中药骨康对体外培养界膜分泌TNF-α表达抑制的实验研究
作者：胡年宏 ，丁文玲 ，刘庆思
摘 要: 目的: 观察中药骨康体外培养假体周围界膜TNF-α的影响。 方法: 将备用的人工假体周围界膜放入RPMI培养液中（含15%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素），用眼科剪剪成1mm 3 大小组织悬浮液。取24孔培养板1块，分对照组、10%骨康组、20%骨康组3组，培养72h，取上清液，酶联法测定TNF-α。 结果: 骨康10%浓度组与对照组相比无显著性差异（P>0.05），而骨康20%浓度组与对照组相比有显著性差异（P<0.05）。 结论: 骨康高浓度时能抑制假体周围界膜TNF-α的分泌。
关键词: 中药骨康;假体界膜;TNF-α;体外培养
人工关节置换术后最重要的并发症是假体周围骨溶解导致的假体无菌松动，松动的机理还不完全清楚。随着骨代谢研究的进展，调节破骨细胞形成和功能的肿瘤坏死因子（TNF-α）在人工关节置换术后无菌松动中的作用成为人工关节研究的新热点。本研究拟建立界膜组织培养法，并初步探讨中药骨康含药血清对体外培养界膜TNF-α分泌的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
Hank's液;RPMI-1640培养液;10%胎牛血清（购于永兴公司，杭州四季青制造）;TNF-α试剂盒（由武汉博士德公司提供）;中药骨康煎剂，广州中医药大学附属骨伤科提供（由黄芪、肉苁蓉、丹参、女贞子、淫羊藿、川芎组成）;界膜组织15g（取自73岁男性患者，行骨水泥型人工关节术后7年松动下沉来行返修术者）。
1.2 主要仪器
培养箱（美国SL）;超净工作台（上海净化设备厂）;酶标仪（Barad3300）。
1.3 方法
①骨康含药血清的制备:骨康为中药煎剂，由广州中医药大学附属骨伤科医院生产，骨康方总生药量110g，取2剂剂量即220g加入1000mL水中煎煮浓缩到150mL，即含生药量1.43g/mL，按 4.8g/kg剂量灌胃，相当临床剂量的10倍。大鼠 用上述药物分别灌胃，每次17.5mL/kg，每天2次，间隔5h，连续灌胃3d，最后一次灌胃2h后腹主动脉取血，离心获取血清，灭活，抽滤除菌，置-20℃保存备用。
②体外界膜组织培养:参照有关 〔1，2〕 ，将备用的人工假体周围界膜（15g）从低温冰箱中取出，待融解后，将界膜放入Hank's液中清洗后置于RPMI-1640培养液中（含15%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素），然后将界膜标本用眼科剪剪成1mm 3 大小组织悬浮液。取24孔培养板1块，分空白对照组、骨康组，后者又分10%含药血清浓度组及20%含药血清浓度组两个亚组，共计3个组，每组8个培养孔。对照组中加1mL组织悬浮液，10%含药血清浓度组中加0.9mL组织悬浮液，20%含药血清浓度组中加0.8mL组织悬浮液。
③骨康含药血清的添加:10%含药血清浓度组加入0.1mL骨康含药血清。20%含药血清浓度组加入0.2mL骨康含药血清。添加药物后在5%CO 2 、37℃饱和湿度下培养72h，取上清液。
④TNF-α含量测定:培养72h后，取上清液，用酶联法测定TNF-α。
⑤上述界膜组织标本同时做细菌培养。
1.4 统计分析
测定的所有数据应用SPSS11.5统计软件，采用方差分析统计分析。
2 结果
界膜组织和不同浓度含药血清的骨康共同培养72h，应用酶联法测TNF-α，结果是骨康低浓度组与对照组相比无显著性差异（P>0.05），而骨康高浓度组与对照组相比有显著性差异（P<0.05）。见表1。 表1 培养72h界膜组织
3 讨论
3.1 界膜的组成及在骨溶解中的作用
1975年，Charnley 〔3〕 首先发现假体周围存在一层界膜组织，证实骨水泥周围的界膜组织中存在大量巨噬细胞和异物巨细胞。随后的研究表明，无论是否应用骨水泥，在骨―骨水泥界面或骨―金属界面之间均存在着这种含大量组织细胞的结缔组织界膜。研究 〔4〕 认为界膜主要由纤维基质、单核和多核组织细胞以及慢性炎细胞构成，可形成一些皱褶或乳头状突起，与骨性关节炎滑膜有相似之处。应用组织学技术和细胞表面标志蛋白的免疫化学分析技术研究显示，界膜组织中含有MΦ、异物巨细胞、成纤维细胞、破骨细胞及淋巴细胞。界膜组织细胞分泌不同细胞因子产物能影响骨转换，这些细胞因子包括IL-1、IL-6、TNF-α。尽管假体周围界膜中细胞构成不同，但从失败的骨水泥型和非骨水泥型假体周围界膜中均含有这些细胞因子，这些细胞因子能调节炎性反应，这些炎性反应介质在假体周围骨溶解及假体松动过程中起重要作用 〔5〕 。其中TNF-α最为重要。
3.2 TNF-α引起假体周围骨溶解的作用机制
骨重建是通过破骨细胞性骨吸收和成骨细胞性骨形成来完成骨改建过程。它具有维持人一生中骨有机联接的不可或缺的作用。破骨细胞的过度活跃将会导致绝经后骨质疏松症及伴有炎症疾病的关节破坏和全身骨量丢失如类风湿性关节炎。
TNF-α是一种介导天然免疫的细胞因子，它在类风湿性关节炎骨与关节破坏的病理过程中起决定作用。并证实它在牙周炎疾病的骨溶解、人工关节松动及其他慢性炎症骨溶解中亦起关键性作用 〔6，7〕 。TNF-α能直接激活破骨细胞，体外研究发现，巨噬细胞吞噬磨损颗粒后，可分泌大量TNF-α，使其浓度提高12倍。TNF-α能募集破骨细胞并激活破骨细胞，尽管还有其他许多细胞因子能募集破骨细胞并激活破骨细胞，但TNF-α起决定性作用 〔8〕 。Schwarz 〔9〕 认为假体周围骨溶解是由于巨噬细胞吞噬磨损颗粒后，激活核转录因子（nuclear transcription factor-kappaB，NF- К B）并传递信号，从而增加TNF-α的分泌，TNF-α直接诱导成纤维细胞增殖和组织纤维化，募集或激活破骨细胞来吸收邻近骨质。
3.3 中药骨康对界膜分泌TNF-α的影响及机制
骨康是根据原发性骨质疏松症的肾虚、脾虚、血瘀病因病机的特点而组方，具有补肾健脾和活血化瘀功效，由淫羊藿、补骨脂等中药组成。中药骨康含药血清能直接抑制体外培养的破骨细胞功能 〔10〕 ，促进破骨细胞凋亡。本实验中骨康含药血清在10%血清浓度时对体外培养界膜组织分泌的TNF-α无明显影响（P>0.05），而在20%血清浓度时能明显抑制体外培养界膜组织分泌TNF-α。现代研究认为补肾中药可降低TNF-α水平，周丕琪 〔11〕 等研究了补肾法对绝经后骨质疏松患者IL-6、TNF-α的影响，采用补肾中药密骨片，连服6个月，系统观察了30例绝经后骨质疏松患者前后体征、骨密度、骨代谢生化指标，同时检测IL-6、TNF-α水平变化，结果患者在骨密片作用下，骨痛症状明显缓解，骨密度增高，IL-6、TNF-α水平下降，说明补肾法通过影响细胞因子分泌而达到治疗骨质疏松目的。
〔1〕Lavigre P，Jolicoeur FC，Penetier JP，et al.Modulation of IL-1β、IL-6、TNF-alpha and PGE 2 by pharmacological a-gents in explants of membranes from failed total hip re-placement［J］.Osteoarthritis Cartilage.2002，10（11）:898-904.
〔2〕范卫民，马益民，王青，等.人工关节松动病因研究［J］.南京医科大学学报，2002，11（2）:33-36.
〔3〕Charnley J.Low friction arthroplasty of the hip.Theoryand practice［M］.Berlin:Springer，1979，3-15.
〔4〕蔡 讠胥 ，王继芳，卢世壁，等.无菌性松动假体周围界膜的组织学及超微结构特征［J］.中华医学杂志，2000，80（11）:826-830.
