RNAi抑制内源性基因表达在肝脏疾病研究中的应用

                作者：赵中夫　张国英　杨慧　刘明社　韩德五

【关键词】  RNA干扰技术

　　关键词  RNA干扰技术;内源基因;TNF-α;Fas;caspase-8
           
　　RNA干扰（RNA interference，RNAi），即用核苷酸组成的短的双链RNA（dsRNA）代替传统反义核酸进行转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing PTGS）。自2001年、2002年连续两年被美国《Science》杂志评选为年度10大突破技术之一以来，2003年～2004年继续热度高涨，已经迅速而广泛地应用到基因功能、基因表达调控机制研究等热门领域，并为基因开辟了新的途径。RNA干扰技术，以其高度的特异性和有效性，在功能基因组学研究中，被认为是非常有用的工具。在医学研究中，它不仅能有效抑制外源性基因的表达，显示较好的抗病毒应用价值，而且，能非常特异地沉默内源性基因的表达，为我们通过选择性地抑制有害基因表达，研究抗炎症、抗凋亡、抗肿瘤等治疗策略提供了新思路和方法 ［1］ 。
    
　　1 RNA干扰机制及技术原理
    
　　当病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21bp～23bp），即siRNA。
    
　　siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。RISC与外源性基因或内源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，因RISC具有核酸酶的功能，在结合部位可以切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。另外，siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsR-NA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解 ［2］ 。
   
　　RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征:①RNAi是转录后水平的基因沉默机制;②RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的mR-NA  ［3，4］ ;③RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能完全抑制相应基因的表达;④dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。大于30bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而使细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡;⑤ATP依赖性:在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程 ［5］ 。

    RNA干扰技术的关键是要根据内源或外源靶序列来设计合成由21nt～23nt组成的siRNA或者siRNA表达载体，并以某种方式将其导入靶细胞中，从而诱发靶序列的特异性降解，阻止靶序列继续表达和翻译。

    人体的许多疾病是由外源基因入侵或内源基因突变和异常表达所引起的。针对以病毒感染为主的外源基因入侵的RNAi研究已经广泛开展并取得了一定成果。如抗HIV  ［6～8］ 、抗HCV  ［9，10］ 、抗脊髓灰质炎病毒 ［11］ 和鼠疱疹病毒 ［12］ 、抗HBV  ［13］ 等，而针对由于内源基因突变或异常表达所引发的疾病，RNAi同样发挥重要作用。现就RNAi抑制某些内源性基因过度表达或肿瘤基因表达在肝脏疾病中的应用研究进展情况报告如下。
    
　　2 RNAi对内源性基因的抑制作用
    
　　2.1 RNAi抑制体内TNF-α过度表达　TNF-α是一具有多种生物学活性的多肽调节因子，来源于单核巨噬细胞。适量的TNF-α可以调节机体免疫功能，对维持机体内部的稳定状态及抵御各种致病因子具有重要意义。然而，TNF-α的异常分泌又可作为机体炎症、损伤及休克的重要介质 ［14］ 。

    近年来，肠源性内毒素血症（intestinal endotox-emia，IETM）与肝病的关系日益受到重视，急、慢性肝炎、重型肝炎、肝硬化与肝癌患者的IETM发生率报道不一，其中以重型肝炎患者IETM的发生率（80%～100%）为最高、程度最为严重。内毒素可通过两个途径激活肝脏枯否细胞，一是膜连接形式（mCD14），mCD14是经典的CD14依赖途径，由脂多糖结合蛋白（LBP）将LPS运送至枯否细胞膜上与相应受体CD14结合，激活细胞内信号转导系统，最终导致NF-κB的活化，促进TNF-αmRNA及其它细胞因子转录产物的形成，释放大量促炎细胞因子，扩大了炎症反应 ［15］ 。其中TNFα是最为关键的促炎细胞因子。TNFα吸引中性粒细 胞进人肝脏，并促使其产生呼吸爆发，释放氧自由基，导致脂质过氧化反应，加重肝坏死。TNF-a能诱导肝窦内皮细胞和肝细胞大量表达ICAM-1，并可促进细胞毒性T淋巴细胞攻击肝细胞，导致肝细胞大量坏死。TNFα免疫组化定位研究表明，TNFα还参与了内毒素介导的肝纤维化过程。

    可见，TNF-α的过度表达与肝病严重程度及暴发性肝衰竭的发病机制密切相关。因此，以TNF-αmRNA为靶点，采用RNAi技术特异性抑制TNF-αmRNA的表达，减少TNF-α的分泌，对降低肝细胞损伤，保护肝细胞功能具有重要意义。Sorensen DR等用阳离子脂质体SiRNA抑制TNFa基因的表达，成功地达到在小鼠体内抗内毒素诱导的肝脏损伤，败血症小鼠的存活率明显增加 ［16］ 。

　　2.2 RNAi抑制Fas过度表达　Fas是肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族的细胞表面分子，其配体FasL同Fas结合后可以导致携带Fas受体的细胞凋亡。Fas和FasL结合被阻断或因基因突变而丧失功能，可以发生淋巴细胞增殖性疾病及自身免疫加剧，肝细胞的过度凋亡同样可以引发肝功能衰竭。

    经研究发现，正常人肝细胞不表达Fas抗原，病毒感染肝细胞后可使受损肝细胞表达Fas抗原，且表达程度与肝脏损伤的严重程度一致。表达FasL的CTL等细胞同Fas结合引发病毒感染肝细胞的凋亡，达到清除病毒的目的。在乙型肝炎病毒引起的重症肝炎发病时可出现细胞凋亡的特征性变化。重症肝炎的病因之一就是CTL破坏病毒感染的细胞，而在CTL和活化淋巴细胞表面都发现有FasL，并且还发现Fas抗原表达较强的肝细胞分布上主要集中于“碎屑样坏死”边缘浸润的淋巴细胞中间 ［17］ 。这些都提示重症肝炎发病时有Fas/FasL系统参与，通过肝细胞表达的Fas引起肝细胞大量死亡。如果抑制Fas过度表达，就可以保护肝细胞，避免重症肝炎发生。

    Song等研究人员从小鼠尾静脉注射Fas siR-NA，发现可以特异性降低Fas mRNA水平以及肝细胞中Fas蛋白的表达，并且这一效应可以持续10d而不减弱。分离用Fas siRNA处理过的小鼠肝细胞，让其暴露于Fas特异性抗体，或者同刺激肝脏单核细胞的ConA共同培养，可以产生对凋亡的抵抗。在注射Fas特异性抗体而导致的严重暴发性肝衰竭小鼠模型中，用Fas siRNA进行处理，发现82%的小鼠可以生存10d，而所有的对照鼠则在3d内死亡了。因此，应用RNAi技术特异性沉默Fas的表达可以保护肝细胞，避免其受到细胞毒性损伤 ［18］ 。

    
　　2.3. RNAi抑制caspase8基因表达阻断凋亡通路　Caspase是哺乳动物中具有相同作用的一类半胱氨酸蛋白酶家族。细胞凋亡的发生是蛋白酶有序级联切割的结果，与此级联切割反应相关的蛋白酶根据在细胞凋亡过程中被活化时间的先后和作用的不同，分为三大类，即起始蛋白酶（initatorpro-tease），放大蛋白酶（amplifier protease）和效应蛋白酶（machinery protease），其代表分别为caspase-8（FLICE/MACHI），caspase-1（ICE）和caspase-3（YAMA-cpp32β） ［17］ 。caspase-8作为凋亡起始蛋白酶，可以同TNFR1及Fas诱发的凋亡信号转导通路中共同信使FADD的死亡效应区（DED）相结合，继而活化同类其它蛋白酶分子，启动caspase的级联切割程序，引起多种“死亡底物”迅速降解，导致细胞凋亡。如果caspase-8过度表达，就会使组织细胞大量损伤，出现器官功能衰竭。

    急性肝衰竭是死亡率极高的严重临床综合症，因此，人们设想如果能阻断死亡受体介导的细胞过度凋亡，就可以保护肝细胞并且维持肝脏功能。Zender和他的同事应用caspase-8siRNA抑制鼠肝细胞中caspase-8的表达，发现能够显著减轻Fas介导的肝细胞凋亡。用caspase-8siRNA处理过的肝细胞，在应用抗Fas抗体及FasL腺病毒表达载体（AdFasL）后，肝细胞的损伤明显下降。如果先用AdFasL或野生型腺病毒（Adwt）处理小鼠，再用caspase-8siRNA作延迟，仍然能够显著提高动物的生存率 ［19］ 。
    
　　2.4 RNAi抑制癌基因和突变型抑癌基因的表达　许多癌基因或抑癌基因均可以作为siRNA的作用靶点。p53基因为抑癌基因，并同细胞凋亡有密切关系，其基因产物p53蛋白是一转式激活蛋白，作为“基因警卫”负责维持细胞基因完整性、DNA损伤修复和细胞周期的正常运转。但是p53基因是多种肿瘤中突变频率最高的抑癌基因，大约60%的肿瘤都有p53突变，这时p53就会失去对细胞的监视作用，细胞则因遗传不稳定而产生突变和染色体畸变，最后导致细胞癌变。如果以突变型p53基因为靶点设计siRNA进行干扰，则可以阻断突变型p53的促癌作用。 胎儿甲种球蛋白（AFP）正常情况下主要来自胎儿肝细胞，当胎儿出生2W后AFP便会从血液中消失。当肝细胞发生癌变时，可以大量产生AFP，AFP一方面可以促进肝细胞的增殖，另一方面有经研究证实，在AFP的作用下，肝细胞内突变型p53表达量增加，野生型p53的正常抑癌功能被抑制，有促进HeLa细胞增殖的作用 ［20］ 。如果以AFP基因为靶点进行RNA干扰，就可能在早期预防肝细胞癌的发生或者延缓肝细胞癌的。

    还有学者认为肿瘤细胞生长需要血液的供应，因此具有血管依赖性，而血管内皮生长因子同血管形成密切相关，如以VEGF基因为靶点设计siRNA进行作用的话，也会起到很好的抑制肿瘤生长和转移的作用 ［21］ 。
    
　　3 RNA干扰技术在肝脏疾病治疗中的应用前景
    
　　综上所述，RNAi在肝脏疾病研究的应用不仅实现了体外细胞培养的抑制效应，而且达到了体内抑制相关基因的表达的目的。提示该技术在肝脏疾病治疗和研究方面的重要价值。然而，RNAi技术真正应用到人体还有许多工作要做。如:通过尾静脉加压、快速注射siRNA的方法，在人体是不可能实施的。因此，安全有效的人体注入方法将是需要进一步研究的热点和难点。另外，有关siRNA干扰相关基因表达可能出现的近期副效应，特别是远期副效应我们还知之较少，临床前期还应有更多的动物实验证据。但是，随着这项技术的不断成熟和应用研究的不断深入，它必将为肝脏疾病的防治开辟有益的新途径。
    
　　
    
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