血管内皮生长因子受体抑制剂对哮喘模型小鼠的抗肺部炎症作用
作者：李良昌，李宜丹，金东洙
【摘要】 ［目的］观察血管内皮生长因子受体抑制剂对哮喘模型小鼠肺部炎症的影响.［方法］利用鸡卵清蛋白诱导建立小鼠哮喘模型，观察血管内皮生长因子受体抑制剂（SU5614）对小鼠肺部感染、支气管肺泡灌洗液中细胞总数和白细胞分类的变化情况.［结果］哮喘模型组小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞总数、中性粒细胞计数和嗜酸性粒细胞数明显增加，SU5614组则明显降低.HE染色显示哮喘模型组小鼠肺部炎症明显，而SU5614组则明显减轻.［结论］在小鼠哮喘模型中血管内皮生长因子受体抑制剂SU5614具有明显的抗肺部炎症作用.
【关键词】 哮喘;血管内皮生长因子；炎症
ABSTRACT:OBJECTIVETo study the effects of the VEGF receptor inhibitor (SU5614) on lung inflammation in OVA induced mice asthma.METHODSUsing the OVA induced mice asthma, it was observe that the effects of SU5614 for total cells and leukocyte differential count in bronchoalveolar lavage fluid counted with a hemocytometer.RESULTSThe total cells, neutrophils and eosinophils were significantly increased in asthma model group mice comparing with control group model mice, but decreased in SU5614 group mice compared with asthma model group mice. The lung inflammation was significantly obvious in asthma model group mice, and abatement in SU5614 group mice compared with asthma model group mice by histopathology.CONCLUSIONAn VEGF receptor inhibitor, SU5614, may reduce lung inflammation in a OVA induced mice asthma.
Key words:asthma;vascular endothelial growth factor;inflammation;mice
支气管哮喘是慢性气道炎症性疾病，而新生血管的生成和生长是炎症过程中的特征性变化[1，2].血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是促进血管形成和引起炎症反应的细胞因子，在支气管炎症和支气管重塑过程中起着重要作用[3,4].SU5614，5?Chloro?3?[(3,5?dimethylpyrrol?2?yl)methylene]?2?indolinone是特异性VEGF2型受体Flk?1抑制剂，可特异性地抑制VEGF的生物效应.利用鸡卵清蛋白诱导建立哮喘动物模型具有制作方法简单，时间短，效果理想可靠等特点，已被列入常规实验方法[5].本实验利用鸡卵清蛋白诱导建立小鼠哮喘模型，通过阻断VEGF的生物效应，观察了小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞总数、白细胞分类的变化及肺部病改变，探讨了VEGF受体抑制剂对哮喘模型小鼠的抗肺部炎症作用.
1 材料与方法
1.1 实验动物及给药方法 选择无特异病原体影响的6～8周龄雄性昆明种小鼠32只，由延边大学医学部实验动物科提供，体重为18～22g，随机分为4个组，即正常组、对照组、哮喘模型组及SU5614组，每组各为8只.于第1，13日腹腔注射给予除正常组外的各组小鼠0.1g/L鸡卵清蛋白生理盐水溶液致敏，剂量为200μL;第21～23日连续雾化吸入给予哮喘模型组及SU5614组小鼠0.1g/L鸡卵清蛋白生理盐水溶液，第20～23日腹腔注射给予SU5614组小鼠2.5mg/kg SU5614;第21～23日雾化吸入给予对照组小鼠生理盐水.
1.2 实验取材 行最后一次雾化吸入后，麻醉开胸，暴露肺和心脏，用1mL注射器抽尽右心室内血液；剪开颈前部皮肤，剥离气管周围软组织，暴露并剪断气管上端，插入细导管，缓慢灌注预冷的PBS缓冲溶液，再缓慢回吸支气管肺泡灌洗液，离心，取上清液置于-70℃超低温冰箱内，待用；切取肺组织置于100g/L中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋，常温保存.
1.3 支气管肺泡灌洗液细胞计数 利用血球计在光学显微镜下取5个视野，平均值作为总细胞计数.离心分离灌洗液，沉淀细胞行涂片染色，光学显微镜下计数200个细胞用于细胞分类计数.
1.4 HE染色观察 常规固定，脱水，包埋及切片，行HE染色观察肺部感染情况，采用TD2000国产高清晰度彩色医学图像分析系统进行图像采集.
1.5 统计学处理 所有数据均以均数±标准偏差（±SD）表示，利用SPSS11.0统计软件进行处理，对细胞总计数、分类计数百分数的比较用方差分析，组间比较采用LSD?t检验.
2 结果
2.1 支气管肺泡灌洗液中细胞计数 正常组小鼠支气管肺泡灌洗液细胞总数和分类细胞数与对照组相比较无明显差异（P＞0.05）；哮喘模型组小鼠支气管肺泡灌洗液细胞总数比对照组明显增多，相比较具有显著性差异(P＜0.01)；SU5614组小鼠支气管肺灌洗液细胞总数与哮喘模型组相比较明显减少，具有显著性差异(P＜0.01).各组小鼠支气管灌洗液中巨噬细胞数间无显著性差异（P＞0.05），哮喘模型组小鼠嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及淋巴细胞数明显高于对照组，相比较均有显著性差异(P＜0.05)；SU5614组小鼠嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及淋巴细胞数与哮喘模型组相比较均明显减少，具有统计学意义(P＜0.05)，见表1. 表1 各组支气管肺泡灌洗液中各类细胞数量的变化
2.2 HE染色观察 与正常组（图1）比较，对照组（图2）小鼠气道上皮稍水肿，此外未见明显差别.哮喘模型组（图3）可见较多的炎症细胞从血管渗出，并向支气管周围定向移动，气道上皮增厚，细胞肿胀、脱落，气道腔变窄.SU5614组(图4)表现为气道上皮细胞肿胀、脱落，支气管周围炎症细胞数明显减少.
3 讨论
支气管哮喘是由多种细胞参与的慢性气道炎症，尤其是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞.支气管组织内嗜酸性粒细胞的积聚及活性的增高对支气管哮喘有着重要的作用[6，7]，嗜酸性粒细胞炎症反应是鸡卵清蛋白诱发支气管哮喘的主要病理生理特征，而新生血管的形成和生长对支气管哮喘的和修复过程起着重要的作用［1］.VEGF亦称血管通透因子，具有多种功能，通过与特异性受体结合来刺激内皮细胞的增殖及移行，增加血管通透性，促进血管形成，在血管新生、骨折愈合及炎症等过程中发挥着重要作用.VEGF的3种高亲和力结合位点位于血管内皮细胞上，如Flt?1，Flk?1，Flt?4，均是跨膜受体，属于RTK Ⅲ型，共同特点是催化域内有酪氨酸激酶插入区.该酪氨酸激酶的活性通过受体和配体结合而被激活，由受体磷酸化引起细胞内许多酶和其他反应，在细胞的生长和分化中起重要作用［4］.在上述3种受体中2型受体Flk?1与哮喘的关系最为密切.SU5614是特异性的Flt?1抑制剂，可抑制VEGF发挥其生物效应.本实验结果表明，给予SU5614后哮喘模型小鼠气道上皮细胞厚度，支气管周围炎症细胞数及支气管腔内炎症细胞总数均显著减少.综上所述，认为VEGF受体抑制剂SU5614对小鼠哮喘模型具有明显的抗肺部炎症作用，但其机制尚需进一步研究阐明.
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