慢性乙型肝炎基因治疗策略研究进展

来源:岁月联盟 作者:邓益斌,王燕菲 时间:2010-07-12

【关键词】  肝炎 乙型 慢性 基因疗法 基因 DNA 反义 RNA 反义

  慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染引起的、病死率较高的一种慢性传染性疾病,易为肝硬化、肝癌。据资料显示[1,2],全球约有3.5亿慢性乙肝患者,我国是慢性乙肝高发区,约有1.3亿患者。目前,基因治疗作为一种全新的治疗理念越来越受到人们的关注。基因治疗是指将外源性的有特定功能的目的基因(DNA或RNA片段),通过一定的技术手段导入靶细胞内,成为宿主细胞遗传物质的一部分,在一定条件下目的基因表达产物对疾病起治疗作用的一种治疗方式。当前基因治疗的研究热点主要集中在探索适宜的治疗基因、构建理想的载体以及对导入基因表达的调控与监测等方面。笔者将着重从反义RNA技术、反义DNA技术、核酶技术、锁核酸与锁核酸核酶、RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术和显性阴性突变体等几个方面对基因治疗策略的现状作一综述,以期为抗HBV基因治疗研究提供。

  1  反义RNA技术

  1.1  反义RNA的作用机制 

  反义RNA(antisense RNA)亦称反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASODN)是指按碱基互补配对原则与单链mRNA特异性结合,形成部分双链核酸,定点封闭靶基因,阻断特定基因表达的一小段(20~30bp左右)人工合成的RNA分子,具有精确选择性和高度特异性,而且能显著抑制病毒复制,被认为是一种较理想的基因治疗药物。反义RNA可能通过以下几种反义作用机制达到抗HBV的目的:①反义RNA互补于特定的mRNA的非编码区,影响核糖体的结合,从而抑制翻译;②反义RNA互补于特定的mRNA的编码区,抑制翻译;③反义RNA通过激活RNaseH,使mRNA易于被核酸酶降解;④反义RNA作用于靶mRNA的5'端,阻止帽子结构的形成,影响靶mRNA的成熟;⑤反义RNA作用于3'端的poly(A)尾的形成,阻止靶mRNA的成熟及其向胞浆内的转移;⑥反义RNA作用于外显子与内含子的连接区,阻止mRNA前体的剪接。通过以上几种机制,反义RNA可以在翻译水平阻断HBV的mRNA的表达。

  1.2  依不同基因位点而设的ASODN的抗HBV能力 

  自20世纪90年代初Goodarizi首次报道了反义RNA能特异抑制HBV-DNA复制现象以来,先后有许多研究者在这一研究领域做了大量卓有成效的工作。然而,有效的反义RNA序列的设计仍然依赖于对病毒基因组结构与调控序列的研究进展。因此,必须选择那些对病毒生存和复制至关重要的基因部位进行反义抑制,而把作用于不同位点的多个反义RNA同时使用或串联或杂合反义核酸,达到阻止多个有害基因的表达,从而更好地发挥其抑制HBV的作用,这是值得研究的一个方向。
   
  根据HBV基因组表达、复制特点,设计出针对S、C、P、X、前C(preC)、前S1(preS1)和前S2(preS2)基因的反义RNA,特别是针对那些调节序列,如DR1、DR2、U5、增强子、启动子、帽子结构和poly(A)尾等,有可能获得更为有效的抑制作用。Korba等[3]评价了56条不同的针对HBV特定功能区的ASODN抑制HBV复制、表达的能力,结果表明,针对S基因与前S1基因区的ASODN可抑制细胞释放HBsAg及病毒颗粒,但不影响胞内HBV复制;针对S基因起始区的ASODN抑制HBsAg的产生最为有效;针对C基因区的ASODN抑制病毒颗粒产生,降低细胞内HBcAg的水平及HBV-DNA复制中间体的产量;针对多聚酶编码基因区的ASODN不影响HBV复制水平,但可降低细胞释放HBeAg的水平;针对HBV ε元件的上茎及环区的ASODN是HBV复制的最有效抑制剂。同时,还发现56条ASODN无一条影响HBV特异性RNA转录的水平,证明这些ASODN的作用机制是通过抑制mRNA翻译而实现的,因此,认为针对特定功能基因区关键位点的ASODN能阻断相应的功能蛋白的产生。ε元件的上茎及环区的结构是影响ε元件功能的关键因素,因此封闭该区就能有效抑制HBV的包装,从而抑制HBV的复制。
   
  HBV X基因的表达产物X蛋白有反式激活功能,它可以反式激活多种细胞及病毒启动子,激活HLA-1抗原启动子和多种细胞原癌基因启动子。HBV X蛋白与肝癌的发生密切相关,因此,抑制X蛋白的产生对预防HBV慢性感染后肝癌的发生具有重要的临床价值。刘素侠等[4]针对HBV X基因3个位点:翻译起始区、DR2、ENⅡ,设计合成了3条ASODN,其在HepG2.2.15细胞中观察其抗病毒活性与作用特性。结果发现,ASODN对HBV的抑制作用有“双峰现象”,即抑制效果达到最佳后下降到一定程度又回升,这可能跟一次性用药有关。Ma等[5]针对HBV X基因设计了反义RNA,应用逆转录病毒转染HepG2.2.15细胞系,其HBsAg及HBeAg抗原表达分别下降37.9%和36.8%,HBV-DNA降低25%。

  1.3  ASODN技术存在的问题 

  尽管ASODN抗病毒的作用为人们治疗HBV感染展示了广阔的前景,但是仍然存在着一些问题:①ASODN主要通过封闭HBV的mRNA来抑制HBV的复制与表达,而HBV的复制模板DNA仍然存在,因此,一旦停止治疗,HBV仍可能重新复制,显然研究如何封闭超螺旋HBV-DNA是一个值得考虑的方向;②ASODN在体内及细胞内的稳定性有待提高;③ASODN及其代谢物的安全性、副作用,尤其是长期毒性目前也知之甚少,这些都需要做更进一步的研究。

  2  反义DNA技术

  由于反义RNA技术对源源不断产生的mRNA难以全部阻断,因而很难实现完全抑制HBV复制。因此,人们的注意力开始转向研究能封闭病毒基因的反义DNA技术。所谓的反义DNA技术是指脱氧寡核苷酸能与双链DNA特异性结合,形成三链DNA,从而阻止基因转录,故又称三链DNA技术。为了与反义RNA技术相区别,又将三链DNA技术称为反基因技术。由此可见,反义DNA技术抗HBV的反义作用机制是反义DNA与特定的DNA结合形成三链DNA分子,阻止转录因子与DNA结合,从而在转录水平上阻断特定基因的表达,达到抗HBV复制的目的。

  3  核酶技术

  核酶最早是从四膜虫的核糖体RNA前体中发现的。它能催化其他RNA分子转变、降解与聚合,使靶RNA链在某些特殊部位断裂,重新连接起来,而自身却无消耗,它是一种真正意义上的酶。而且核酶在切断mRNA后又可以从杂交链上脱落下来,重新结合并切割其他mRNA,故其抑制作用明显强于反义RNA。目前已广泛应用于病毒性疾病(如HIV感染、HBV感染、HCV感染等)的治疗研究。HBV基因组含有四个开放读码框,即前S/S区、前C/C区、P区和X区。前S/S区编码大、中、小3种包膜蛋白,前C/C区编码HBeAg和HBcAg,P区编码聚合酶,X区编码X蛋白。HBV-DNA进入宿主肝细胞核内,在宿主酶的作用下,以负链DNA为模板延长正链,修补正链中的裂隙区,形成共价闭合环状DNA(cccDNA),后以cccDNA为模板,在宿主RNA聚合酶Ⅱ的作用下,转录成几种不同长度的mRNA,其中3.5kb的mRNA含有HBV-DNA序列上的全部遗传信息,称前基因组RNA(pgRNA)。pgRNA进入肝细胞质中后作为模板,在HBV逆转录酶作用下,合成负链DNA,再以负链DNA为模板,在HBV-DNA聚合酶作用下,合成正链DNA,形成子代双链环状DNA。因此,针对各基因组研究设计能切割mRNA及pgRNA的核酶具有抗HBV的作用。Hoeprich等[6]用噬菌体phi29的pRNA为载体,将针对HBV-poly(A)的外源核酶连在pRNA的5'端与3'端之间,通过与载体相连方式修饰过的核酶能有效防止被核酸外切酶降解,在培养细胞中抑制HBV复制的效果明显提高。Morrissey等[7]用化学方法对核酶进行修饰,以提高核酶的稳定性,包括对核苷酸甲基或烯丙基化、硫代磷酸交联等。修饰后的核酶在HBV转基因小鼠体内试验表明,能够有效降低血浆中HBsAg、HBeAg及HBV-DNA的含量。

  脱氧核酶(DNAzyme)是具有酶活性的DNA分子,是继核酶后人们对酶认识的又一次重大飞跃。与核酶相比,脱氧核酶具有抗降解性强、结构简单、催化效率高等优点。对底物的切割催化作用,脱氧核酶也较核酶有更显著的位点专一性和序列特异性。Wo等[8]设计的针对HBV S基因和C基因的特异性脱氧核酶,作用于HepG2.2.15细胞后可显著抑制HBV S基因、C基因的表达,对HBsAg、HBeAg分泌的抑制率达90%以上。脱氧核酶的出现为研究治疗RNA病毒感染性疾病开辟了一条新途径。

  4  LNA与LNAzyme

  4.1  LNA 

  LNA是一种新型、特殊的双环状寡核苷酸衍生物,结构中核酶的2'-O,4'-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,形成了刚性的缩合结构,增加了磷酸盐骨架的局部结构的稳定性。LNA作为一种新的反义核酸,具有与DNA/RNA强大的杂交亲和力、反义活性、抗核酸酶能力、水溶性好和体内无毒性等特点。LNA用于抗HBV感染的基因治疗,国内学者唐盈等[9]在这一领域做了大量的研究工作,取得了初步成绩。通过设计针对HBV S基因同一位点的LNA、反义寡核苷酸、硫代反义寡苷酸,作用于HepG2.2.15细胞后,均能抑制HBsAg的表达,抑制率分别为52%、42%和45%,而LNA表现出更强的抗病毒活性。

  4.2  LNAzyme 

  LNAzyme是脱氧核酶(DNAzyme)的一种衍生物,是一种经过LNA修饰的DNAzyme,即在DNAzyme的两个结合臂上引入一个或多个LNA单体。LNA的引入大大增加了LNAzyme与底物的杂交亲和力,增强了切割反应的酶促活力,使LNAzyme较相应的DNAzyme切割效率明显提高,而且切割的底物既可以是短的RNA也可以是较长的和结构较复杂的RNA。Rester等[10]设计的针对HBV前C/C区的同一位点的DNAzyme、硫代DNAzyme和LNAzyme,作用于HepG2.2.15细胞后观察它们对HBsAg、HBeAg表达抑制情况,结果显示LNAzyme的抑制作用最强,且对细胞未见明显的毒性作用。胡玉琳等[11]设计合成针对HBV前C/C区2031位点的10-23DNAzyme、点硫代修饰的10-23DNAzyme及LNAzyme,作用于HepG2.2.15细胞后,结果也显示了LNAzyme对细胞的HBsAg、HBeAg表达的抑制效应最强。

  5  RNAi技术

  RNAi也称基因沉默(gene silencing),是最近发现和起来的新型基因阻断技术,是通过利用dsDNA诱发对宿主细胞特异性RNA转录的抑制,从而抑制特异目的基因的表达[12]。机制是在细胞中导入dsDNA,切割酶Dicer(由核酸内切酶和解旋酶等组成)将dsDNA剪切为21~23bp的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),siRNA与酶蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),RISC根据碱基互补配对原则与靶向mRNA结合,在ATP参与下利用酶切作用降解mRNA,从而导致目的基因表达沉默,而RISC则可继续参与下一个RNAi作用循环[13]。RNAi是动植物抵制病毒入侵,保持基因完整的天然防御机制,而有些细胞可能缺少Dicer酶不能将dsRNA裂解为siRNA,使病毒逃逸了免疫监视。因此,可以通过体外合成和细胞内表达两种方式获得siRNA,促使宿主细胞内形成RISC,启动基因沉默机制,达到抗病毒作用。
   
  体外研究证明,RNAi技术可有效抑制病毒基因的表达。Konishi等[14]以HBV poly(A)区和S基因区为靶点,人工化学合成siRNA,分别作用于HepG2.2.15细胞,结果显示对HBsAg的表达有明显的抑制作用,抑制率分别为78%和42%,但是作用时间较短。而Strayer等[15]通过载体表达获取siRNA或小发夹RNA(shRNA),导入淋巴细胞、肝细胞和神经细胞中,发现siRNA和shRNA可在这些细胞中稳定的持续的表达,这一研究结果克服了体外合成siRNA作用时间短的缺点。Shlomai等[16]采用载体pSuper携带HBV-DNA的C区(pSuperC)或X区(pSuperX)序列,在质粒H1启动子调控下表达shRNA,分别转染pSuperC或pSuperX 72h后,其相应的蛋白表达均明显降低。而将两者分别与含1.3倍HBV基因的载体结合,共转染Huh7肝癌细胞株,C蛋白和X蛋白分别下降89%和63%,明显高于单个靶点的抑制作用。还发现以X基因为靶点的shRNA,对变异株(HBV Xmut)细胞中的X蛋白表达无影响,但对表达HBV病毒颗粒的细胞株仍可抑制HBV复制。以上研究结果提示多个靶点联合可提高RNAi抑制病毒复制的效果。
   
  RNAi不仅在体外细胞实验中有效,体内实验也显示其高效的抗病毒复制能力。McCaffrey等[17]针对HBV S基因区设计的shRNA具有显著的抑制效果,抑制率达94%,在免疫缺陷小鼠中肝细胞HBV-RNA水平较对照组下降了84.5%,小鼠血清中C蛋白的表达也显著下降,抑制率达99.7%。Uprichard等[18]针对HBV的siRNA通过重组腺病毒载体有效地进入HBV转基因小鼠的肝脏,可完全抑制转基因鼠中HBV达4周之久,显示了siRNA的效果。

  6  DNM

  DNM是将病毒重要结构或功能蛋白突变,从而制造出一个人工重组干扰蛋白。该蛋白与病毒野生型蛋白相互作用,影响后者发挥其生物效应,干扰病毒正常生存周期以达到基因治疗的目的。突变蛋白使野生型蛋白功能降低或丧失,相对野生型蛋白而言,突变蛋白的功能为显性,两蛋白相互作用的结果是负调甚至是缺失了野生型蛋白的功能。国外研究者报道鸭HBV核心蛋白显性阴性突变体干扰DNA病毒的合成以及C基因突变阻碍核衣壳包装,达到抑制HBV复制的目的[19]。邸雅南等[20]构建C基因截短的真核表达载体pcDNA3-ΔC及野生型C基因真核表达载体pcDNA3-C,分别瞬时转染HepG2.2.15细胞,48h后提取胞内蛋白,SDS-PAGE Western blot结果证明此突变体能高效表达相应蛋白,pcDNA3-ΔC和adWR9共转染组细胞及上清液病毒较对照组低,说明突变体可使HBV复制下降。核心颗粒Native western blot显示pcDNA3-C和pcDNA3-ΔC共转染组杂交带较对照组淡,说明突变的核心蛋白可干扰核心颗粒形成。易军等[21]将VP22全长及其不同区段融合于HBV核心蛋白(HBc)的C端,克隆入pcD-NA3.1(-)构成DN突变体真核表达质粒。转染HepG2.2.15细胞后,观察DN突变体对HBV病毒复制的抑制效应。结果显示VP22及其不同区段构建的DN突变体可在HepG2.2.15细胞中进行表达,且对宿主细胞无毒性。VP22融合型DN突变体可有效地抑制HBV的复制,具有蛋白转导特性的DN突变体比无转导特性的DN突变体具有更强的抗病毒能力。其中VP22全长构成的DN突变体具有最强的抑制效应,可使上清HBsAg浓度下降81.94%。由此可见,通过利用显性阴性核心蛋白突变体抑制正常核心蛋白的功能,干扰核衣壳形成,从而导致HBV复制下降,为乙型肝炎的基因治疗提供了实验基础。

  7  结束语

  基因治疗是一种前景十分看好的针对HBV感染的治疗方式,因此相关的临床与实验研究也越来越多,并且随着研究的深入,已渐渐凸现出基因作为一种治疗性药物的作用。但是要真正实现基因治疗步入实际的临床应用还需要解决许多相关的问题:①基因突变或不同病毒亚型的存在,可能诱导突变和病毒变异;②细胞内多种酶的存在,可能影响核酶和锁核酸核酶的活性;③敏感靶位点的选择,基因传送的肝导向性的精确度,仍需进一步研究;④外源性基因导入后引起肝细胞免疫原性变化;⑤对导入的治疗基因表达调控和监测;⑥导入的治疗基因的稳定性和作用持续性;⑦导入的治疗基因及其代谢物的安全性、副作用与细胞毒性等等。如果上述问题能寻找到更好的解决办法,慢性乙型肝炎的基因治疗有望在临床上发挥巨大作用,应用前景也更为广阔。

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