人GM-CSF基因真核表达载体构建与表达
【摘要】 【目的】 构建以基因佐剂hGM-CSF基因为基础的真核表达质粒pIGM-CSF，并在宫颈癌细胞HeLa中表达与鉴定。【方法】 采用聚合酶链反应从载体pORF-hGM-CSF中，扩增出hGM-CSF基因，克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点B(MCSB)中，构建pIGM-CSF真核表达载体。然后采用脂质体转染法将其转染HeLa细胞，用RT-PCR在RNA水平和ELISA在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。【结果】所克隆hGM-CSF基因片段经测序完全正确；重组质粒转染Hela细胞后，检测有hGM-CSF表达。【结论】 成功构建含基因佐剂真核表达载体pIGM-CSF，并在宫颈癌细胞中能有效表达，为继续克隆目的抗原从而构建双顺反子真核表达质粒奠定了基础。
【关键词】 真核表达载体； hGM-CSF； 基因佐剂； 双顺反子
Abstract: 【Objective】 To construct eukaryotic expression plasmid pIGM-CSF based on gene adjuvant hGM-CSF, and express in Hela cells. 【Methods】 Plasmid pORF-hGM-CSF was used as template to amplify hGM-CSF gene by PCR, and the product was inserted into multiple cloning site’s B of bicstronic eukaryotic expression vector pIRES to construct eukaryotic expression plasmid pIGM-CSF, then transfected into Hela cell by using liposome. Finally, the hGM-CSF gene expression of protein was detected by RT-PCR from RNA level and ELISA from protein level. 【Results】 The length and sequence of the cloned hGM-CSF segment was correct. The hGM-CSF gene could be expressed in transfected Hela cells.【Conclusion】 The eukaryotic expression plasmid pIGM-CSF containing gene adjuvant was successfully constructed and expressed in Hela cells effectively, lays a foundation on constructing bicstronic eukaryotic co-expression plasmid.
Key words: eukaryotic expression plasmid; hGM-CSF; gene adjuvant; bicstronic
目前对DNA疫苗的研究已经成为热点，一些研究表明DNA疫苗对许多病毒[1,2]、细菌[3]、寄生虫［4］、肿瘤[5]和慢性退行性疾病[6]等有预防和作用，还可以调节自身免疫应答。HIV、疟原虫和病人独特型DNA疫苗等已进入人体临床试验[7]，但是核酸疫苗的免疫效果在不同动物个体中差异较大，有些疫苗在小个体的动物中免疫和保护效果较好，而在大个体动物中效果较差。某些肿瘤及病毒的T、B细胞表位抗原性弱，难以诱导有效的T、B细胞免疫应答。基因佐剂(gene adjuvant)可将某些细胞因子编码基因与目的基因克隆到同一载体或不同载体共同免疫动物，其表达的相应蛋白起到佐剂作用，可大大增强T、B细胞的免疫应答水平。为此，我们构建以基因佐剂人粒细胞-吞噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, hGM-CSF)为基础的真核表达载体pIGM-CSF，为今后在该载体上克隆我们所需的目的抗原基因奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 质粒与菌株
大肠杆菌 DH5α 和宫颈癌细胞 Hela 为本实验室保存；载体 pIRES 购自 BD Biosciences Clontech 公司，质粒 pORF-hGM-CSF 购自 InvivoGen 公司。
1.2 主要试剂
Ex Taq DNA聚合酶，T4 DNA 连接酶，限制性内切酶XbaⅠ 和 NotⅠ, DL-1 kb marker，质粒提取试剂盒，DNA胶回收纯化试剂盒购自大连宝生物公司。1 kb DNA marker 和300 bp marker 购于鼎国生物公司。一对PCR引物、重组质粒上目的基因的序列测定由上海生工生物工程公司完成。MMLV逆转录酶和脂质体转染试剂 Lipofectamine 2000 及配套转染液Opti-MEMI Reduced Serum Medium购自Invitrogen公司。人hGM-CSF蛋白ELISA双抗体夹心法检测试剂盒购自深圳市晶美生物科技公司。
1.3 引物设计
参照GenBank上人GM-CSF基因CDS序列分别设计引物如下。上游引物P1： 5′-CA TCTAGA AAGGAGGGCCACCATG TG-3′，含XbaⅠ位点和起始密码子ATG；下游引物P2： 5′-AT GCGGCCGC TGTCGAGC TAGCGAATTC-3′，含NotⅠ位点，含终止密码子TGA。扩增基因长度为474 bp。
1.4 hGM-CSF基因的PCR扩增
以载体pORFhGM-CSF为模板，用引物P1、P2进行PCR扩增hGM-CSF基因，反应体系为50 μL,其中上下游引物各1 μL，dNTP 3 μL，模板DNA 4 μL，10 × Ex Taq Buffer 5 μL，MgCl2 3 μL，Ex Taq 0.4 μL，dd H2O 33 μL，反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共30个循环，72 ℃再延伸10 min。扩增产物取5 μL 进行 12 g/L琼脂糖凝胶电泳，以确定扩增产物大小。
1.5 pIGM-CSF真核载体的构建与鉴定
将hGM-CSF的 PCR产物经过回收纯化后与载体pIRES，同时用XbaⅠ 和 NotⅠ双酶切，酶切后进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，并经过凝胶回收纯化试剂盒回收酶切产物，将两者酶切纯化的产物按照3 ∶ 1的摩尔比混合，用T4 DNA连接酶连接24 h，转化用低温CaCl2制备的E.coli DH5α感受态细菌，然后涂布于含氨苄青霉素50 ?滋g/mL的LB固体培养基中。次日，随机挑取10个单菌落，分别接种于3 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37 ℃下150 r/min振荡培养过夜。将100 μL过夜培养的菌液煮沸后离心取上清液2 μL作为模板以引物P1和P2进行菌落PCR，如果结果经琼脂糖凝胶电泳显示大小正确则用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。将提取的质粒DNA用XbaⅠ和 NotⅠ双酶切，进行电泳检测，以DL-1000 bp marker为分子量参照，将筛选出的阳性克隆产物的菌液进行测序鉴定。测序采用Sanger双脱氧链终止法，对引物所在序列的两端进行测定，测序工作由上海生物工程公司完成。
1.6 重组质粒转染
将HeLa细胞加入含有Lipofectamine 2000及配套转染液Opti-MEMI Reduced Serum Medium的6孔板内，500 ?滋L/孔。取0.7 ?滋g重组质粒DNA和2 ?滋g脂质体分别溶于250 ?滋L 的Opti-MEMI转染液中。5 min后加入到转染专用的管中混匀，室温静置20 min，加入到上述6孔板内，培养6 h后，换成PRMI 1640完全培养基继续培养。
1.7 细胞的培养和传代
冻存的Hela细胞株经复苏后培养于含100 mL/L小牛血清PRMI 1640完全培养基中，在37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，每3 d消化传代一次。
1.8 重组质粒pIGM-CSF转染Hela细胞
转染前1 d将HeLa细胞传代接种在6孔板内，细胞生长至80%～90%时；以Opti-MEM Reduced Serum Medium各250 μL分别稀释5 μg pIGM-CSF质粒和10 μL Lipofectamine-2000转染1孔，培养6 h, 更换PRMI 1640完全培养基继续培养。
1.9 RT-PCR检测hGM-CSF基因表达
分别收集pIRES和pIGM-CSF质粒转染48 h的HeLa细胞，应用已异硫氰酸胍一步法提取细胞中的总RNA ，以Oligo dT为引物，在MMLV逆转录酶作用下，37 ℃ 1 h将RNA逆转录为cDNA。95 ℃灭活MMLV，以cDNA为模板用P1和P2为引物进行PCR，反应体系为50 μL,其中上下游引物各1 μL，cDNA模板10 μL，5× PCR Buffer 10 μL， Ex Taq 0.25 μL，dd H2O 28.75 μL，反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共30个循环，72 ℃再延伸10 min。扩增产物取5 μL进行12 g/L琼脂糖凝胶电泳。
1.10 ELISA法检测hGM-CSF蛋白表达水平
分别收集pIRES和pIGM-CSF质粒转染24 h和48 h的HeLa细胞的细胞培养的上清液，采用ELISA双抗体夹心法检测hGM-CSF蛋白的表达量，按照试剂盒说明进行操作。用酶标仪在吸光度A450下测定样品和试剂盒提供的标准品的A值。根据标准品所测A值绘制的蛋白浓度与A值相关标准曲线各样品中hGM-CSF蛋白的含量。
1.11 统计学处理
实验数据以ｘ±ｓ表示，处理数据统计用SPSS13.0软件包进行分析,组间比较采用两组样本t检验，P< 0.05具有统计学意义。
2 结 果
2.1 hGM-CSF基因的PCR产物电泳分析
12 g/L琼脂糖凝胶电泳的结果显示，PCR扩增产物为均一条带，对比Marker，大小同预期结果一致（图1）。
2.2 限制性内切酶消化鉴定
质粒pIGM-CSF经XbaⅠ 和 NotⅠ双酶切后,电泳可见大小约为6.1 kb与0.47 kb两片段，载体pIRES经上述两个酶双酶切后，仅见一条6.1 kb的片段（图2）。
2.3 序列分析鉴定
对质粒pIGM-CSF上的多克隆位点B(MCSB)内的DNA序列进行序列分析鉴定, 结果与hGM-CSF(NCBI登陆号：M11220)的基因序列完全相同
2.4 RT-PCR结果
如图4所示，在电泳图中转染质粒pIGM-CSF的有hGM-CSF基因条带的出现，而转染了空质粒pIRES的则没有hGM-CSF基因条带的出现。
2.5 ELISA检测结果分析
以空载体pIRES为阴性对照，结果表明，pIGM-CSF在转染24 h和48 h可检测到hGM-CSF分泌，表达水平在标准曲线范围之内，与对照组比较均有统计学意义（表1）。
3 讨 论
细胞因子是一类可溶性的小分子多肽或蛋白质，通过与细胞膜表面受体相互作用发挥其生理活性。细胞因子在体内能激活和调节免疫细胞，通过不同的作用环节调节或增强DNA疫苗的免疫效应而发挥佐剂作用。目前已发现多种细胞因子具有佐剂效应，在DNA疫苗领域研究最为活跃的是IL-2、IL-12、IL-18、GM-CSF和IFN-γ。GM-CSF属于酸性糖蛋白，是一种多效的细胞因子，它具有刺激髓样祖细胞的增殖和成熟并维持髓性细胞的功能特性，促进巨噬细胞的增殖和分化，调节粒细胞和单核组细胞生长和分化，增强成熟的中性粒细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞的功能，以及加强单核-巨噬细胞抗肿瘤和ADCC作用等生物学活性。作为基因佐剂，GM-CSF能够增强CTL、NK细胞活性，但更主要的是调节抗原提呈细胞尤其是树突状细胞的数量和功能来调节免疫应答的强度。Hongxun等[2]将携带GM-CSF基因的重组质粒(pNGV-hFL+3L)作为佐剂与HIV基因疫苗p17HIV共同免疫小鼠，结果在注射部位及其相应的淋巴结中可聚集大量的树突状细胞，并且比单独应用基因疫苗产生更强烈的细胞免疫应答及脾细胞抗原特异性IFN-γ。Zhang等[3]发现将只含有结核杆菌单基因的重组质粒pAg85A和有GM-CSF基因的重组质粒pAg85A/GMCSF同时注射免疫小鼠时，结果pAg85A/GM-CSF组比pAg85A组产生更高水平的IFN-r，并能够增强CTL细胞活性。Miyashita等[5]将克隆的GM-CSF转染JA细胞作为疫苗皮下包埋免疫患食管癌的小鼠，与未转染组比较结果肿瘤体积明显缩小，表明对该肿瘤有抑制作用。实验证明，GM-CSF可以作为免疫佐剂和肿瘤疫苗免疫促进剂[8]。目前国内外对于GM-CSF基因的研究和报道多以鼠mGM-CSF为主，但对于人hGM-CSF基因克隆和研究的报道并不多见。本实验以人hGM-CSF基因为目的基因,主要是为了进一步研究人hGM-CSF基因在DNA疫苗中的免疫学作用,其对今后DNA疫苗应用于临床人体实验比mGM-CSF有着更为重要的临床意义。
本实验所采用的真核表达载体pIRES能在细胞基因组外扩增表达目的基因。质粒pIRES含有人巨细胞病毒启动子、脑心机炎病毒的内部核糖体进入位点（internal ribosome entrysite, IRES），IRES连接两个开放读码框，其转录产物在翻译时，核糖体能同时进入并开始翻译IRES上游及下游的两个转录子[9]。本实验在启动子下游的MCSB的酶切位点XbaⅠ 和 NotⅠ 之间插入人hGM-CSF构建含有基因佐剂功能的真核表达质粒pIGM-CSF，并通过RT-PCR在RNA水平和ELISA在蛋白水平检测其在真核细胞中表达。现已有研究认为以pIRES为双表达质粒将目的抗原与细胞因子共表达在不同的实验系统中均显著增强免疫力[10,11]。我们成功构建含基因佐剂hGM-CSF的真核表达质粒，为下一步在该载体上克隆我们所用的抗原基因研制新型优效的DNA疫苗奠定了基础。
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