人类免疫缺陷病毒-1 nef诱导凋亡及下调人类白细胞抗原-I类分子
作者：黄官友， 黄秀艳， 曾耀英， 曾祥凤， 吴晓萍
【摘要】 【目的】 研究人类免疫缺陷病毒(HIV)-1 nef 调节细胞表面的人类白细胞抗原(HLA)-I类分子及诱导细胞凋亡情况。【方法】 将293T细胞分为两组，用脂质体法将含HIV-1 nef基因的质粒及空载体分别转染细胞，Western blot检测HIV-1 nef在转染细胞中的表达，荧光抗体染色结合流式细胞术检测细胞表面的HLA-I类分子表达及细胞凋亡情况。【结果】 HIV-1 nef在转染细胞中有表达。转染HIV-1 nef的细胞与转染空载体的细胞经抗HLA-A，B，C-FITC染色后，平均荧光强度分别为205±22及269±15，两者相比有显著性差异（P< 0.01）； 经Annexin V-APC/PI染色后，阳性细胞百分率分别为（60.82±8.32）%及（8.12±5.43）%，两者相比亦有显著性差异（P< 0.01）。【结论】 HIV-1 nef下调细胞表面的HLA-I类分子及诱导细胞凋亡。
【关键词】 人类免疫缺陷病毒-1 nef； 人类白细胞抗原-I类分子； 凋亡； 转染
人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）是引起艾滋病即获得性免疫缺陷综合症的病原体。HIV 主要型别分为HIV-1和HIV-2，我国艾滋病大多由HIV-1引起，一些逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂，融合抑制剂及某些中药[1]等均具有抗HIV-1的作用。在HIV-1感染的患者中，疾病的进展与凋亡，特别是辅助性 T细胞的凋亡呈负相关。大量研究表明，HIV-1的附属蛋白Tat,Vpr,Vpu及Nef 参与调节细胞的凋亡[2]。其中，HIV-1 nef 参与调节细胞的凋亡颇受重视。目前一致认为，HIV-1 nef能够诱导旁观者细胞的凋亡[3,4]，而对HIV-1感染或转染HIV-1 nef 的细胞，多数学者认为HIV-1 nef 抑制该细胞的凋亡[3,5-8]，而少数学者则得出相反的结论[9,10]。因此，对HIV-1感染或转染HIV-1 nef 的细胞，HIV-1 nef 是促进或抑制其凋亡，尚需进一步研究。此外，有报告显示HIV-1 通过其nef 下调细胞表面的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC) I类分子而逃避宿主细胞毒T细胞（cytotoxic T cell, CTL）的攻击而保护感染细胞[11]。由于细胞凋亡是程序性细胞死亡，而HIV-1 nef 下调细胞表面的MHC I类分子意味着这种HIV-1 蛋白保护感染细胞免受死亡。从导致死亡的角度来说，细胞凋亡和细胞表面MHC I类分子的下调互为矛盾。对于转染HIV-1 nef 的细胞，是否同时具备细胞凋亡及细胞表面MHC I类分子下调的特性，本文作一定的分析。
1 材料和方法
1.1 材料
SVCMV 载体及SVCMV nef质粒为加拿大Manitoba大学Xiaojian Yao教授所赠。脂质体LipofecfamineTM 2000购自Invitrogen,抗HIV-1 nef抗体购自Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的马抗山羊IgG购自北京鼎国生物技术有限公司，化学发光底物Supersignal West Pico Kits 购自Pierce公司，PVDF膜购自Roche公司，RIPA buffer 购自Sigma公司，抗人HLA-A，B，C-FITC单克隆抗体及膜联蛋白（Annexin V）-APC均购自BD公司，DMEM及胎牛血清（FBS）均购自GIBCO公司，FACSCalibur流式细胞仪购自Becton Dickinson公司。293T细胞为本实验室自备。
1.2 细胞培养和转染
以含10%FBS和DMEM培养293T细胞。DNA的脂质体转染法按Lipofectamine TM 2000的说明书所示进行操作，即：①在转染前一天铺细胞，注意每盘细胞中所放置的细胞的数量要相等，所加培养液的量要一致。转染时细胞达覆盖生长面的50%~70%，②准备A液（脂质体+无血清的DMEM，两者比例为10 μL ∶ 250 μL）及B液（DNA+无血清DMEM，两者比例为4 μg : 250 μL）分别混匀后室温下静置5 min，然后混合A液与B液，室温下静置20 min，其中，DNA与脂质体的比例为4 μg : 10 μL；④将待转染细胞的培养液换为无血清DMEM，吸取A，B混合液，逐滴滴入含待转细胞的培养液中，注意每盘细胞中所加的DNA量要相同。4 ~ 6 h后，以含10%FBS的DMEM换液。转染48 h收集、计数细胞，取3×106细胞作Western blot，取0.5×106 细胞作流式细胞术分析。
1.3 Western blot 测定HIV-1 nef的表达
收集转染48 h的细胞离心（120 × g, 5 min），吸弃上清液，加入40 μL RIPA butter，混匀后置冰上，30 min后，4 ℃离心（13 400 × g, 20 min），取上清液，加入点样缓冲液，沸水浴5 min，点样，样品在含12.5%的聚内烯酰胺（PAGE）凝胶中电泳。电泳后将PAGE凝胶中的蛋白通过电转移槽转至PVDF膜。用3%的脱脂乳封闭已转PVDF膜2 h，继后加入一抗anti-HIV nef （PBS 1∶ 400稀释），4 ℃封闭过夜后，用PBS洗膜5次，每次5 ~10 min。洗膜后加入二抗辣根过氧化物酶标记的马抗出羊IgG（PBS 1 ∶ 500稀释），室温下缓慢振荡1 h，再用PBS洗膜5次，每次5 ~10 min，最后用化学发光试剂盒显色、曝光，对HIV-1 nef的表达进行检测。
1.4 荧光抗体染色结合流式细胞术检测细胞表面的HLA-A，B，C分子及测定细胞凋亡
取转染48 h细胞, 离心（300 × g，5 min），弃上清液，PBS洗涤细胞后再离心，去掉上清液。若检测细胞表面的HLA-A，B，C分子的表达，将细胞重悬于300 ?滋L PBS中，加入抗人HLA-A，B，C-FITC 1.0 ?滋g，混匀后室温避光静置25 min，PBS洗涤一次，弃上清，将细胞重悬于300 ?滋L PBS中，立即上机检测；若测定细胞凋亡，将细胞重悬于300 ?滋L染料结合缓冲液中，振荡混匀，加入5 ?滋L Annexin V-APC，混匀后室温避光静置15 min，然后，加入5 ?滋L的PI，混匀后再作用5 min，立即上机检测。全部数据经FACSCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取并分析。FITC为荧光1（FL1），PI为荧光2（FL2）,APC为荧光4（FL4）。
1.5 统计学方法
实验结果用统计软件包SPSS 10.0进行处理，数据以ｘ±ｓ表示，多组间相比采用One way-ANOVA，两组间比较用t检验。
2 结 果
2.1 HIV-1 nef目的基因的鉴定
扩增并抽提质粒SVCMV及SVCMV nef。DNA电泳结果显示质粒SVCMV nef 较SVCMV大（图1）。同时，将SVCMV nef送去测序，测序结果显示，目的基因HIV-1 nef序列正确。
2.2 Western blot 鉴定HIV-1 nef 的表达
转染48 h的293T细胞，经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜后，以1 ∶ 400稀释的抗HIV-1 nef抗体进行标记，化学发光试剂盒显色、曝光，对HIV-1 nef的表达进行 检测。结果示转染SVCNV的细胞，无蛋白条带，而转染SVCMV nef的细胞，可见分子量为27 ku的蛋白条带（图2）。本试验重复3次，结果一致，列出其中一次结果（下同）。
2.3 流式细胞仪测定细胞表面的HLA-A，B，C分子及细胞凋亡
空载体或HIV-1 nef 转染48 h的细胞，经抗人HLA-A，B，C-FITC染色后用流式细胞仪分析，结果显示，细胞表面HLA-A，B，C分子的阳性率分别为(95.40±2.24)％及(93.60±2.93)％，两者相比无显著性差异（t＝8.69, P > 0.01），而两种转染细胞的平均荧光强度分别为269±15及205±22, 两者相比有显著性差异（t＝11.26, P< 0.01，图3A）。转染48 h的293T细胞，用Annexin V-APC/PI染色后，经流式细胞仪检测，结果显示SVCM或SVCMVnef转染的细胞，Annexin V＋PI－细胞所占的百分比分别为（8.12±5.43）%及（60.82±8.32）%，两者相比有显著性差异（t＝-8.21, P< 0.01，图3 B）。
3 讨 论
3.1 HIV-1 nef 下调MHC I类分子的表达
机体要产生针对HIV-1 及其它病毒感染的适应性免疫应答，需要一定数量的组织相容性复合物I类分子来递呈感染细胞表面的病毒抗原。CTL通过识别MHC I类分子递呈的抗原肽，杀伤感染细胞。然而，病毒通过下调感染细胞表面MHC I类分子的表达而逃避宿主CTL的杀伤 。研究发现，HIV-1是通过其nef 下调细胞表面的MHC I类分子[11]。HIV-1 nef 下调MHC I类分子的能力与HIV-1的进程相关。来自疾病进展缓慢者HIV-1 nef下调MHC I类分子的能力较弱，而来自病程进展迅速者的HIV-1 nef下调MHC I类分子较为明显[12]。因此，研究HIV-1 nef下调MHC I分子有着重要的意义。本实验结果表明，HIV-1 nef转染的细胞与空载体转染的细胞比较，细胞表面的HLA-I类分子明显下调（P< 0.01）。既往的报告亦得出类似的结论[11]。因此，HIV-1 nef下调转染或感染细胞表面的MHC I类分子是确定的。由于MHC I类分子下调，转染HIV-1 nef的细胞不能有效地被CTL识别而受到保护。因CTL杀伤靶细胞需启用两种机制：细胞裂解及细胞凋亡，故推测HIV-1 nef具有保护转染或感染细胞免受凋亡的特性。
3.2 HIV-1 nef调节细胞的凋亡
本文资料说明，转染HIV-1 nef的细胞较空载体转染的细胞更易发生凋亡。这与Lee等[9,10]的研究结果一致。有关HIV-1 nef 调节转染或感染含其相应基因的细胞的凋亡情况，报道颇有争议。部分学者认为HIV-1 nef可作用于细胞信号通路而抑制细胞的凋亡，其中的机制包括：①HIV-1 nef抑制凋亡信号调节酶（ASK1）。ASK1系Fas和肿瘤坏死因子α（TNF-α）死亡信号通路中的关键酶 。HIV-1 nef通过抑制该酶而抑制Fas和TNF-α介导的凋亡[3]。②活化P21-活化激酶(PAK)。HIV-1 nef结合并活化PAK上游的磷酸甘油3-激酶（PI3K），进而激活PAK，致Bad蛋白磷酸化[5]。③HIV-1 nef与P53蛋白结合，降低P53蛋白的半衰期、DNA结合能力及转录活性，从而阻止P53介导的凋亡[7]。④上调抗凋亡基因BCL-XL的表达而抑制凋亡[8]。HIV-1 nef的抗凋亡效应体现在它能够对抗HIV-1诱导的凋亡，保护HIV-1感染的宿主细胞[3,6]。而另一部分研究者则认为，HIV-1 nef诱导感染或转染含HIV-1 nef基因的细胞的凋亡。Rasola等[10]的实验表明，HIV-1 nef通过多种机制而增强细胞凋亡，包括降低抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表达，激活半胱天氡蛋白酶及非半胱天氡蛋白酶通路而诱导凋亡。Lee[9]则认为HIV-1 nef通过作用于C-Jun N未端 （JNK）上游的信号蛋白Vav、Cdc42及Rac1等而激活JNK，促进细胞的凋亡。分析[3,5-10]发现HIV-1 nef在多种细胞或细胞系中均能促进或诱导细胞的凋亡,提示HIV-1 nef调节凋亡和细胞类型无关。
HIV-1 感染的细胞寿命较短，但其存活时间较未感染的旁观者细胞长，提示HIV-1感染的细胞在一定程度上发生了凋亡，这可能与HIV-1 nef调节凋亡有关[2]。我们认为，HIV-1 nef调节凋亡具有两面性：细胞在某一特定状态下，HIV-1 nef促进其凋亡；而在另一特定状态下，HIV-1 nef则抑制其凋亡。至于在何种情况下HIV-1 nef促进或抑制感染或转染含该病毒蛋白基因的细胞的凋亡，有待于进一步的研究。
3.3 HIV-1 nef 调节凋亡与下调MHC I类分子的关系
从本实验可以看出，转染了HIV-1 nef 的293T细胞，其表面的HLA-A，B，C分子下调。下调了HLA-A，B，C分子的293T细胞理应具有抗凋亡特性，而实验结果却显示该转染细胞有明显的凋亡。分析可能的原因：①细胞表面的MHC I类分子下调后的抗凋亡效应需要在有CTL存在的情况下才能体现出来。而对HIV-1感染的患者，体内有一定数量的CTL，推测HIV-1 nef 下调其感染细胞表面的MHC I类分子所致的抗调亡效应仍然存在。这可能系HIV-1 nef 保护HIV-1感染的细胞免受凋亡的一个重要原因。②HIV-1 nef调节凋亡具有两面性，转染了HIV-1 nef的293T细胞在这一特定的状态下发生了凋亡。
综上所述，我们认为，HIV-1 nef下调细胞表面的MHC I类分子是持续存在的，而其诱导细胞凋亡是暂时的，有条件的。由于MHC I类分子的下调，HIV-1感染的细胞可能持久地免受宿主CTL的攻击。在HIV-1感染早期，HIV-1 nef保护感染细胞免受调亡，大量感染细胞存活，导致病毒大量复制。致感染晚期，感染细胞不能再提供病毒复制所需的材料，HIV-1 nef遂诱导感染细胞的凋亡。因此，若在感染早期，设法让HIV-1的病毒蛋白，包括HIV-1 nef，过早诱导感染细胞凋亡致病毒不能大量复制，可能有助于HIV-1患者的。
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