RP-HPLC测定尿液中阿魏酸哌嗪的含量

               作者：高秀蓉　许小红　廖昌军　廖丽云 

【摘要】  　　目的 建立尿液中阿魏酸哌嗪含量的测定方法。方法 采用RP-HPLC法，色谱条件为：Alltech C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相甲醇-0.02mol/L磷酸二氢钾溶液（35:65,pH3.8）；流速1.0ml/min；检测波长310nm；柱温 40℃。结果 阿魏酸哌嗪在0.06μg/ml～2.5μg/ml浓度范围内线性关系良好（r = 0.999 9）,低、中、高三种浓度（0.5、1.0、2.0μg/ml）溶液，加样回收率分别为98.41%、99.85、98.65%，RSD分别为1.02%、0.98%、0.87%（n=5）。结论 该方法能灵敏、准确的测定尿液中阿魏酸哌嗪的含量。

【关键词】  RP-HPLC；阿魏酸哌嗪；尿药浓度

    Abstract：Objective To establish a method of RP-HPLC for determination of piperazine ferulate in urine.Methods An RP-HPLC method was adopted:a Alltech C18 column(250mm×4.6mm，5μm）was used with a mobile phase of CH3OH-0.02mol/L KH2PO4（35:65,pH3.8）;the flow speed was 1.0ml/min,the detective wavelength was 310nm and the temperature of column was 40℃.Results The linear range was 0.6μg/ml～2.5μg/ml(r=0.999 9),with the average recovery rate 98.41%，99.85%and98.65%,and RSD 1.02%，0.98%and0.87%(n=5)in correspondence to low,medium and high-concentration solution of PF respectively.Conclusion The concentration of piperazine ferulate in urine can be determined sensitively and accurately by RP-HPLC.

    Key words:RP-HPLC;piperazine ferulate;urine concentration

   阿魏酸哌嗪片的主要有效成份—阿魏酸哌嗪(piperazine ferulate，PF)，系根据传统的活血化瘀药川芎素的有效成分阿魏酸的化学结构设计合成的新药。阿魏酸哌嗪片有改善模型动物的肾功能，减轻模型动物肾脏组织损害的作用，同时还具有抗凝、抗血小板聚集、扩张微血管、增加冠脉流量、解除血管痉挛等作用。主要用于各类伴有镜下血尿和高凝状态的肾小球疾病，如急性肾炎、慢性肾炎、肾病综合征早期尿毒症以及冠心病、脑梗死、脉管炎等的辅助，对肾小球疾病疗效确切而成为治疗该病首选药品之一［1］。阿魏酸哌嗪口服吸收后大部分以原型药物从尿液中排泄，若尿药浓度与血药浓度线性相关良好，则可以用尿药数据法代替血药数据法判断药物在体内的经时过程。本文探讨运用RP-HPLC测定人体口服阿魏酸哌嗪片后尿液中阿魏酸哌嗪的含量，对［2］报道的方法进行了改进，同时对RP-HPLC法进行了方法学研究。

    1  实验部分

    1.1  仪器和试剂

    高效液相色谱仪（Dionex，美国），包括P680双泵、ASI-100自动进样器、TCC-100柱温箱、UVD170U型紫外检测器；pHS-3C型酸度计（上海精密仪器有限公司）；FA1004型天平（成都方舟科技开发公司）；色谱纯甲醇、分析纯磷 图1  空白尿样HPLC图谱

    Fig.1  HPLC chromatograms of blank urine(A)、control solution with blank urine(B)、urine of PF(C)

    酸二氢钾（成都化学试剂厂）；双蒸水。阿魏酸哌嗪片剂（四川大学华西药学院提供）。

    1.2  色谱条件

    Alltech C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.02mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH至3.8，35∶65）；流速1.0ml/min, 检测波长310nm,柱温 40℃。

    1.3  阿魏酸哌嗪对照品制备

    精密称取阿魏酸哌嗪对照品25.0mg，置50ml棕色量瓶中，加流动相稀释至刻度，混匀；取1ml此溶液置100ml棕色量瓶中，加100ml流动相稀释至刻度，混匀，制得浓度为5μg/ml的标准贮备溶液，置冰箱保存备用。

    1.4  样品的处理

    取2ml尿样加1ml甲醇，漩涡混合1min，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液20μl，待测。

    1.5  方法学考察

    1.5.1  方法专属性  按“1.2”项下色谱条件及样品处理方法，分别测定空白尿样、PF对照品加空白尿样和已处理尿样，HPLC图谱如图1。

    结果表明，空白尿样对PF的测定没有干扰。

    1.5.2  标准曲线的制备  取空白尿样1.0ml, 置一干燥试管中，精密加入标准贮备液1.0ml，混匀，再加入甲醇1.0ml，按“1.2”项条件分别进样20、16、12、8、4、2、1、0.5μl，以峰面积为纵坐标，样品浓度为横坐标，进行线性回归，求得回归方程为：

    C=0.077 69 A+0.010 69,r=0.999 9,

    可知在0.06μg/ml～2.5μg/ml浓度范围内，测定方法线性良好，可用于测定。

    1.5.3  重复性试验  精密称取阿魏酸哌嗪对照品5份，每份25.0mg，按“1.3”项的方法制备和测定，峰面积，RSD值为0.97%，表明该方法重复性良好。

    1.5.4  精密度试验  精密吸取阿魏酸哌嗪对照品标准贮备溶液高、中、低三种浓度各10μl，按“1.2”项方法分别重复进样5次，计算峰面积积分值的RSD，高、中、低三种浓度分别为1.35%、0.84%、0.62%，表明方法精密度良好。

    1.5.5  回收率实验  精密吸取已知含量的PF对照品标准贮备液适量，分别加入一定量的PF对照品，配成低、中、高三种浓度（0.5、1.0、2.0μg/ml）溶液，按“1.2”项方法进行测定，回收率分别为98.41%、99.85%、98.65%，RSD分别为1.02%、0.98%、0.87%（n=5）。

    1.5.6  样品测定  取已处理好的样品，按“1.2”项条件用HPLC检测5位受试者尿液中阿魏酸哌嗪的含量，记录峰面积，以标准曲线计算样品浓度。测定结果见表1。

    2  讨论

    2.1  阿魏酸哌嗪在尿液中的测定方法有报道，用紫外检测、HPLC法、外标法定量可以测定，但文献方法存在一些缺点,如样品处理简单,方法的准确性及样品对仪器的污染等问题还有待考察。本文采用甲醇，能较好的将尿液中的杂蛋白沉淀，过滤后即可进行检测。 表1  样品测定结果

    2.2  本文曾李太平等文献［2］的方法，但未能检测到本品，后来对此方法进行改进，将流动相的pH调到4.0以下后，能检测到本品，且峰形和保留时间均较好。

    2.3  通过方法学考察，本方法专属性很好，从色谱图可以看出，尿液中的其它杂质基本上不对本品测定造成干扰，灵敏度、准确性也较好，是检测尿液中阿魏酸哌嗪的好方法。

    2.4  从HPLC图谱中，发现尿液样品峰旁有一单峰，推测系阿魏酸哌嗪在人体内的代谢产物，待测定。

【参考文献】
  ［1］贾红慧，李强华，代可一.阿魏酸哌嗪对肾炎模型动物肾功能的改善作用［J］．华西药学杂志，2004，19（6）：415.

［2］李太平，刘玉华.高效液相色谱法测定尿中阿魏酸哌嗪的含量［J］．药学杂志，2002，22（12）：738.