甲基东莨菪碱和吡啶斯的明对鼠应激性体温过高反应的影响

                  作者：杨永录　赖雁　何彦芳　樊萌　李欣 

【摘要】  　　目的 外周胆碱能神经参与细菌内毒素或者内生致热原引起的发热，本实验的目的是探讨是否外周胆碱能神经对应激性发热也有类似的作用。方法 用无线遥测方法观察皮下注射甲基东莨菪碱和吡啶斯的明对大鼠在开放环境中应激性体温过高和活动的影响。用分光光度技术测定血浆胆碱酯酶的活性。结果 外周胆碱能受体阻断剂甲基东莨菪碱可阻断暴露在开放环境中大鼠的体温过高反应，与盐水组大鼠比较体温升高明显减弱。给大鼠吡啶斯的明可引起血浆胆碱酯酶的活性降低52%，而导致暴露在开放环境中大鼠的体温过高反应明显提高。给动物注射甲基东莨菪碱后，立即给吡啶斯的明，几乎可以抵消甲基东莨菪碱对开放应激体温反应的影响。但是，这两种药物对暴露在开放环境大鼠的活动没有影响。结论 实验结果表明，吡啶斯的明和甲基东莨菪碱可以影响暴露在开放环境中大鼠的体温调节反应，提示外周胆碱能神经参与大鼠应激性体温过高反应的调节。

【关键词】  体温；应激性体温过高；外周胆碱能神经

    Abstract：Objective It has been reported that peripheral cholinergic nerve may be involved in the fever induced by bacterial endotoxin or endogenous pyrogen.The aim of present experiment was to investigate whether peripheral cholinergic nerve has also similar effect on stress-induced hyperthermia.Methods Effects of subcutaneous injection of methyl scopolamine and pyridostigmine on stress-induced hyperthermia and motor activity were observed in rats by radio telemetry in an open-field chamber. Plasma cholinesterase(ChE)activity was measured by a spectrophotometry.Results Methyl scopolamine,a peripheral muscarinic antagonist,leaded to a significant attenuation in the hyperthermic response to open-field exposure compared with rats dosed with saline.The rat with pyridostigmine that caused a 52% decrease in plasma ChE activity led to a significant enhancement of the hyperthermic response to open-field exposure.Pyridostigmine coadministered with methyl scopolamine nearly abolished the effects of methyl scopolamine on core temperature during open-field stress.But the rats treated with pyridostigmine and methyl scopolamine were not effected significantly on motor activity to open-field exposure compared with rats dosed with saline.Conclusions Experimental data showed that methyl scopolamine and pyridostigmine could interfere with the thermoregulatory response to open field exposure,and indicated that peripheral cholinergic nerve involved in the control of stress hyperthermic response in the rat.

    Key words:body temperature;stress hyperthermia;peripheral cholinergic nerve

   动物研究发现，用手轻轻的触摸、测量结肠温度、调换动物笼以及更换饲养环境，均可引起大鼠、小鼠和家兔的体温快速升高［1，2］。这种体温升高现象称为应激性体温过高（Stress hyperthermia）或精神性体温过高(Emotional hyperthermia)［2，3］。人处于精神紧张状态或情绪激动时也会出现这种体温过高现象［3］。退热药水杨酸钠和消炎痛能部分阻断应激性体温升高反应［4］。另外，在正常室温和冷暴露时应激性体温过高反应的幅度是相似的，提示应激性体温过高的调节方式与炎症性发热是相似的，是通过提高产热或抑制散热或二者共同作用所致［4］。所以也有人把这种体温过高现象称为应激性发热（Stress-induced fever）或精神性发热（Emotional fever）［2，3］。Romanovsky等发现，外周胆碱能神经可能在发热反应中起作用［5］。本实验的目的是探讨是否外周胆碱能神经对应激性发热也有类似的作用。

    1  材料与方法

    1.1  动物和试剂

    实验用3个月龄的雄性Wistar大鼠，体重为190～230g。在25℃左右环境中单笼饲养，明暗时间各为12h，允许动物自由进食进水。甲基东莨菪碱和吡啶斯的明为Sigma公司产品，分别用无菌生理盐水溶解。

    1.2  应激性体温过高的复制

    大鼠应激性体温过高用暴露在开放实验箱的方法来复制［5］。本实验的开放环境箱是由50cm×50cm×50cm的有机玻璃制成，在开放实验箱的上方悬挂两支荧光灯用于照明，箱体的4周为白色，底部为棕色，顶部敞开。实验时开放环境箱放入人工气候箱内。

    1.3  动物手术

    用 ５％戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉（50mg/kg）动物，按照常规手术方法切开腹部皮肤和肌肉，放入无线温度遥测探头(Data Sciences international,model TA10TA-F40)后，缝合腹部肌肉和皮肤，然后肌肉注射青霉素以防感染。手术后将动物分别单个饲养在标准的大鼠笼中，动物室的温度为25℃左右，空气的相对湿度为50%，明暗时间各为12 h。实验前最少要让动物恢复10 d。

    1.4  体温和活动的测量

    用无线遥控测温仪（Radio telemetry）测量大鼠的体温和活动的变化。将腹腔内置有无线温度遥测探头的大鼠放入清洁的标准鼠笼中，然后置于遥控测温仪的接收板（Receiver board）上，让动物处于自由活动、进食和进水状态，每间隔2 min记录一次鼠笼中和开放实验箱中大鼠体内无线温度遥测探头的遥测信号，将无线温度遥测探头测量到的体温和活动信号由接收板接收后，输入机储存和数据处理。

    1.5  实验步骤

    实验分为4组，每组7只大鼠。对照组：皮下注射无菌生理盐水（1ml/kg）；甲基东莨菪碱组：皮下注射甲基东莨菪碱（1mg/kg）；吡啶斯的明组：皮下注射吡啶斯的明（0.1mg/kg）；甲基东莨菪碱＋吡啶斯的明组：同时皮下注射甲基东莨菪碱（1mg/kg）和吡啶斯的明（0.1mg/kg）。

    实验前一天，大鼠称体重放入清洁鼠笼，然后将鼠笼放入25℃的人工气候箱。开放环境箱放入人工气候箱中鼠笼上方的金属架上，让大鼠在人工气候箱中进行适应性过夜。气候箱的明暗时间为12∶12 h，上午6时开灯，下午6时关灯。

    第二天10时，分别给大鼠皮下注射生理盐水、甲基东莨菪碱、吡啶斯的明或者同时给甲基东莨菪碱和吡啶斯的明后，立即将大鼠放入开放环境箱中，60 min后将大鼠从开放环境箱移回到原鼠笼中，继续观察3 h。

    大鼠在开放实验箱中1 h的体温变化是根据体温-时间曲线和体温指数(TRI)来判断。 TRI是表示体温曲线与时间基线之间的面积(℃×h)。动物的活动变化是计算出在开放环境1 h活动的平均值进行分析。

    1.6  胆碱酯酶的测定

    给药后60 min,即开放实验结束时，用乙醚麻醉大鼠，然后用肝素化的注射器进行心脏穿刺取血。血标本在5℃条件下离心（4 000 r/min,15 min），取血浆存储于-30℃以备测胆碱酯酶。用分光光度法测定血浆中胆碱酯酶的活性，胆碱酯酶测定盒为南京建成生物工程研究所产品。

    1.7  统计分析

    实验数据用均数±标准差(±s)表示，采用配对t检验或团体比较t检验进行统计分析。

    2  结果

    2.1  甲基东莨菪碱和吡啶斯的明对大鼠应激性体温过高的影响    所有实验动物给药前体温是相似的，从给药后放入开放环境箱到第一次测量体温（2 min）时，体温降低了约0.1℃。将动物从开放环境箱放回鼠笼可引起短暂的体温升高现象（图1-3）。

    对照组动物放入开放环境箱中体温快速升高达0.8℃,从开放环境箱放回鼠笼体温逐渐恢复，2 h末恢复到正常水平（图1）。给大鼠甲基东莨菪碱后放入开放环境箱中，体温也出现升高现象，但这种体温升高要比给盐水大鼠低，而且稳定的持续于实验全过程。给大鼠甲基东莨菪碱后放入开放环境箱中的体温变化曲线和TRI以及恢复期的体温变化均明显低于对照组大鼠（图1和图4）。

    大鼠皮下注射吡啶斯的明后，立即暴露到开放环境箱中时，体温过高反应与盐水组大鼠比较明显升高，其体温过高反应要比给盐水组高0.4℃左右（P＜0.05)，当放回到原鼠笼时，体温恢复所需要的时间与盐水大鼠相同（图1和图4）。

    但同时给大鼠注射吡啶斯的明和甲基东莨菪碱几乎可以阻断甲基东莨菪碱对开放应激体温过高的抑制作用。大鼠在开放实验箱和恢复期的体温变化与对照组大鼠比较几乎是相似的（图3和图4）。

    2.2  甲基东莨菪碱和吡啶斯的明对大鼠开放实验活动的影响图2  大鼠皮下注射吡啶斯的明置于开放实验箱中体温和活动的时间曲线所有实验动物在开放环境箱中的活动水平均持续高于鼠笼中的活动水平（图1、2和3）。给药物后，将大鼠放入开放环境箱到第一次记录活动（2 min）时，大鼠的活动是突然增加，然后缓慢降低。但是，吡啶斯的明和甲基东莨菪碱对开放实验条件下大鼠的活动与给盐水大鼠比较没有明显影响（图4）。将动物从开放环境箱放回鼠笼可引起短暂的体温升,然后逐渐降低，到2 h末恢复到正常水平（图1、2和3）。

    2.3  血浆胆碱酯酶的活性

    分别给大鼠皮下注射盐水、吡啶斯的明和甲基东莨菪碱后置于开放条件下，血浆中胆碱酯酶(ChE)的活性分别为392±32.8,202.2±28.5和402±37.2U/L。实验证明，吡啶斯的明能使血浆中ChE 的活性明显降低，但甲基东莨菪碱对其没有影响（图5）。

    3  讨论

    啮齿类和其它动物通常要远离开阔而空旷的环境，寻找狭小或者隐匿的安全环境。所以将他们放入宽阔环境时，可以引起交感神经-肾上腺系统兴奋而导致体温升高，以及其他各种生理和行为的反应［2］。在正常室温和冷环境中，开放应激性体温过高反应的幅度是相似的，说明应激性体温过高是调节性体温升高，而不是简单的应激反应本身伴随的代谢变化的结果［4］。我们实验室最近的工作证明，腹腔注射AVP能明显降低大鼠应激性体温过高，而注射AVP V1阻断剂则能提高应激性体温过高的反应，证明内源性AVP在应激性体温过高中有负调节作用［6］。图4  大鼠皮下注射盐水、甲基东莨菪碱、吡啶斯的明或者联合给甲基东莨菪碱和吡啶斯的明后置于开放实验箱中体温和活动的变化

    本实验给大鼠注射外周性毒蕈碱阻断剂甲基东莨菪碱能明显减弱开放应激性体温过高的反应。这个发现表明，外周毒蕈碱型受体参与开放应激性性体温过高反应。但用甲基东莨菪碱阻断外周毒蕈碱型受体的作用，对外周毒蕈碱型受体在开放应激性体温过高中如何发挥作用提供的是一个不完整的解释。如果阻断该受体能减弱体温过高反应，那么激动该受体是否可以提高这种反应？一种不穿过血脑屏障的外周抗胆碱酯酶剂吡啶斯的明，是可以反转甲基东莨菪碱作用的一个理想的实验用药，它可短时间的激动毒蕈碱型和烟碱型受体。

    鉴于甲基东莨菪碱能抑制应激性体温过高，所以进一步研究吡啶斯的明是否能反转甲基东莨菪碱作用，可能有助于了解外周胆碱能神经在应激性体温过高中的作用。作者给大鼠同时注射吡啶斯的明和甲基东莨菪碱后，对开放实验期和实验恢复期大鼠的体温影响与对照组大鼠比较几乎是相似的。这就证明，吡啶斯的明可以阻止甲基东莨菪碱对大鼠开放应激时体温过高的影响。另外，给大鼠皮下注射吡啶斯的明可使血浆CHE活性降低52%，而导致开放应激性体温过高反应发生明显的改变。因而，此实验支持了外周胆碱能神经参与大鼠开放应激性体温过高的调控作用。

    虽然，甲基东莨菪碱可导致暴露到开放环境中动物的体温过高反应明显降低，而吡啶斯的明则可升高应激性体温过高反应，但这两种药物却不影响开放环境中动物的活动。为什么阻断毒蕈碱受体可以减弱应激性体温升高，是迷走胆碱能传出神经纤维还是运动神经胆碱能传出神经纤维激动外周毒蕈碱受体，或者与两者都有关，而导致开放性体温过高反应， 还不完全清楚。但有实验证明，切除大鼠的迷走神经能明显降低应激性体温过高的反应［7］，切除隔下迷走神经可减弱LPS的发热反应［5］。另外也认为，一些重要的细胞因子，如白细胞介素(IL)-l、IL-6和肿瘤坏死因子也参与应激性体温过高的调节［8］。然而，本实验大鼠置于开放环境和给该药所观察的时间范围内，是不可能出现细胞因子相对缓慢的作用。细胞因子的作用机制似乎不能解释本实验中甲基东莨菪碱和吡啶斯的明的作用，因为这两种药对应激性体温过高的影响是非常快速的。

    综上所述，可以认为外周毒蕈碱和其他类型的受体可能在外周水平参与激活应激性体温过高的反应，进一步的工作是研究外周胆碱能神经的兴奋与应激性体温过高之间的相互作用。

【】
  ［1］Briese E.Normal Body Temperature of Rats:the Setpoint Dontroversy［J］.Neurosci Neurobehav Rev,1998,22:427-436.

［2］Gordon, CJ.Environmental Stress,in:Temperature and Toxicology［M］.CRC Press,New York.2005,195-231.

［3］Briese E.Emotional Hyperthermia and Performance in Humans［J］.Physol Behav,1995,58:615-618.

［4］Long NC.,Vander A.J,Kluger M.J.Stress-induced Rise of Body Temperature in Rats Is the Same in Warm and Cool Environments［J］.Physiol.Behav,1990,47:773-775.

［5］Romanovsky AA,Ivanov AA,Berthoud HR,et al.Are Vagal Efferents Involved in the Fever Response to Intraperitoneal Lipopolysaccharide［J］.J Therm Biol,2000,25:65-70.

［6］Yang Yong-lu.Role of Arginine Vasopressin in Stress-induced Hyperthermia［J］.Chinese Critical Care Medicine,2002,14:207-209.

［7］Gordon CJ,Rowsey PJ.Role of Vagal Afferents in the Mediation of Chlorpyrifos-induced Fever in the Rat［J］.J Therm Biol,2000,25:91-97.

［8］Watkins LR,Goehler LE,Relton JK,et al.Blockade of Interleukin-1 Induced Hyperthermia by Subdiaphragmatic Vagotomy:Evidence for Vagal Mediation of Immune-brain Communication［J］.Neurosci Lett,1995,183:27-31.