重复经颅磁刺激对大鼠空间学习记忆能力的影响

             作者：陈登榜　代吕霞　曾俊　赖雁 

【摘要】  　　目的 探讨重复经颅磁刺激（rTMS）对大鼠空间学习记忆能力的影响。方法 应用Morris水迷宫检测并比较对照组和rTMS处理组空间学习记忆能力的变化。结果 定位航行实验中rTMS处理组的潜伏期比相应对照组延长，具有统计学意义。rTMS处理组的中环游泳时间/总时间、中环游泳距离/总距离、平台象限游泳距离/总距离、平台象限游泳时间/总时间比对照组减少，但无统计学意义。空间搜索实验中rTMS处理组经过原平台的次数、中环游泳时间/总时间、中环游泳距离/总距离、原平台象限游泳距离/总距离、原平台象限游泳时间/总时间与相应对照组均无统计学意义。结论 rTMS减弱了大鼠空间学习能力，但对大鼠的空间记忆能力无显著作用。

【关键词】  重复经颅磁刺激（rTMS）；Morris水迷宫；空间学习记忆；大鼠

    Abstract：Objective To determine the effect of rTMS on spatial learning and memory in rats.Method The changes of spatial learning and memory in rats of rTMS group and control group were observed with Morris water maze.Results In the fixed position location navigation trail,the latency of exposure of rTMS group increased significantly compared with control group.The percentages of the time and distance spent in the middle and platform quadrant of rTMS group displayed no significant difference from control group.In the spatial explore trail,there were no significant difference between exposure of rTMS group and control group in the times of covering the site where the former platform was placed,in the percentages of platform quadrant swimming path and time,and in the percentages of middle link swimming path and time.Conclusion rTMS could influence spatial learning capability, but has no significant effect on spatial memory in rats.

    Key words:rTMS;Morris water maze;spatial learning and memory;rats

    经颅磁刺激(transcranial magnetic stimulation, TMS)是1985年由Bark AT等人开展起来的一种新的神经电生理技术，具有无痛、无创伤、操作简单、安全可靠等优点。在其基础上，重复经颅磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation, rTMS)得到了并广泛用于临床。rTMS是利用交变的电流产生交变的磁场，再通过交变的磁场产生的电流作用于特定区域的脑组织神经细胞，使其去极化而产生生物效应。高频rTMS能提高皮层兴奋性并影响复杂的脑功能活动。通过对动物细胞和分子水平以及对人的神经生理、神经影像的研究，证实了rTMS对中枢功能有局灶性和间接性影响［1］。rTMS还可导致大脑皮层局部代谢水平增高及局部脑血流增多，在情感障碍性疾病特别是抑郁症方面显示了巨大的应用潜力［2］。近几年还进行了rTMS长时程治疗的研究，包括维持治疗。因此rTMS的安全性越来越受到人们广泛的关注。

    国内外有不少学者就电磁辐射对脑生物效应问题进行了大量研究，其中对学习记忆功能的影响是人们关注的热点之一。本实验旨在rTMS对大鼠空间学习记忆能力的影响方面，探讨rTMS的安全性。

    1  材料和方法

    1.1  实验动物

    健康同批SD大鼠40只，体重200-220克。分别随机分为对照组（control）和rTMS组（rTMS），每组20只。实验动物由四川大学华西医学中心实验动物中心提供。

    1.2  主要实验装置

    1.2.1  重复性经颅磁刺激仪  为本实验室自主研制。工作参数：脉冲频率1～15 Hz，磁场强度0.1- 1.0 T；刺激波形为双相，脉冲宽度为200 μs。自动监控线圈温度，自动调控频率和强度。线圈为环型，外径95 mm，内径55 mm，圈数15。

    1.2.2  Morris水迷宫  Morris水迷宫为直径120 cm，高度50 cm的圆形水池。水池的正上方有一摄像仪，摄像仪连接在一台电脑上，自动记录大鼠在池内活动的全过程，并有配套软件分析大鼠的各种运动参数。

    1.3  实验方法

    1.3.1  动物饲养  自由供水，供食，光照。

    1.3.2  磁刺激  动物适应环境1周后，接受磁刺激的动物开始为期2周的磁刺激。线圈置于大鼠的颅骨顶点上方，与脊柱平行。每只rTMS组大鼠每天接受rTMS 150个连续脉冲刺激（脉冲频率15 Hz，磁场强度1.0 T，脉冲宽度为200 μs。历时10 s）。对照组处理与rTMS组相同，但是线圈不通电（即无电磁脉冲）。

    1.3.3  水迷宫实验  rTMS刺激结束1天后，行水迷宫实验［3］。第一次空间探索实验结束后隔3 d、6 d各加做空间探索实验一次，以更好的反应大鼠的空间记忆能力。水池水面高度30 cm，水温25±1℃。水中添加适量牛奶，使水浑浊，避免大鼠直接看见底面和平台。圆形平台（直径9 cm，高29 cm）位于某一象限中心，平台低于水面1cm。水池以中心点分为四个象限，并在半径上三等分点为同心圆将水池划分为内、中、外三个环。实验期间环境安静，房间内参照物保持不变。

    1.3.4  实验程序包括  ①定位航行实验：实验历时5 d，第一天每只大鼠适应水池120 s。第二天分上午、下午两个时段，每个时段训练3次，训练时以除平台以外的3个象限的边缘的中点各为入水点一次，入水时将大鼠面向池壁放入，自动记录运动轨迹。如果在120 s内任意时刻找到平台，即该次训练结束，如果120 s中未能找到平台，则引导至平台，停留30 s。第三、四、五天同第二天。②空间探索实验：在定位航行实验结束后的第一天，第四天，第七天各做一次空间探索实验。在该实验中，撤去平台，每次任选一个入水点（除原平台象限以外的三个象限边缘的中点）将大鼠面向池壁放入水中，记录120 sec大鼠的时间运动轨迹。

    1.4  实验数据处理

    实验结果用均数表示，并采用SPSS软件进行方差齐性检验和t检验。

    图1  两组大鼠在定位航行实验中潜伏期变化（n=20）

    Fig.1  The changes of latency of two groups in the fixed position location navigation trail（n=20）

    P＜0.05,compared with control

    2  实验结果

    2.1  定位航行实验结果

    2.1.1  定位航行实验中40只大鼠找到平台的时间即潜伏期如图1所示，从图中可以看出rTMS组的潜伏期比对照组明显延长。取后三天的均数行t检验，P＜0.05，有统计学意义。

    2.1.2  定位航行实验中环游泳时间/总时间、中环游泳距离/总距离、平台象限游泳距离/总距离、平台象限游泳时间/总时间分别取后三天的均数如表1所示。行t检验，P＞0.05，rTMS组和对照组无统计学意义。

    2.2  3次空间搜索实验

    结果如表2所示。从表中可以看出随着时间的延长，rTMS组和对照组经过原平台的次数、中环游泳时间/总时间、中环游泳距离/总距离、原平台象限游泳距离/总距离、原平台象限游泳时间/总时间均减少，分别经t检验，P＞0.05，无统计学意义。表1  定位航行实验数据（均数）表2  空间探索实验数据（均数）

    3  讨论

    rTMS可以调节大脑皮层的生物电活动，增强脑组织的兴奋性，进而产生广泛的生物效应，这是其抑郁症的基本机理。但是其广泛的生物效应是会否影响到学习、记忆等脑的复杂功能受到了国内外学者的关注。

    学习和记忆是脑的重要的高级功能之一，目前认为大脑皮层、海马、小脑、杏仁核特别是海马和颞叶皮质与学习和记忆密切相关。某些神经元突触的激活、新突触的形成、新蛋白的合成、神经肽、激素及一些神经递质如乙酰胆碱、多巴胺等都可能参与学习和记忆过程。因此学习和记忆可受到多种因素的影响，有报道，短周期光暗循环能够影响小鼠的学习记忆能力［4］。此外有研究表明，Period1能够影响中脑-边缘多巴胺系统的活动［5］，亦提示Period1可以通过影响多巴胺系统而影响学习和记忆。本实验中，在该实验的rTMS参数下，通过Morris水迷宫对大鼠学习记忆能力的检测发现，rTMS降低了大鼠的学习记忆能力，但对空间记忆能力没有明显作用。那么rTMS是通过什么机制损伤大鼠的学习记忆能力？电磁辐射使海马乙酰胆碱的释放减少影响学习记忆功能［6］，而且电磁辐射具有特异性中枢神经继发损伤效应，可诱导海马神经细胞调亡［7］。赵梅兰等研究发现，电磁脉冲可使海马神经元形态结构、功能及突触可塑性上发生变化,并进一步影响到大鼠学习记忆功能［8］。应用电磁辐射照射大鼠后,发现海马c-fos基因表达上调, 提示电磁脉冲致学习记忆损害可能和c-fos基因表达有关。Boland等研究了电磁辐射对海马培养细胞的作用，发现电磁辐射可以加重NO诱导的氧化应激反应，增加NO的神经损伤作用，从而导致学习记忆损伤［9］。但是由于学习记忆本身的神经生化和分子机制还未完全明了，而且rTMS对学习记忆的影响及影响程度可能与rTMS参数（频率、强度等）有关。因此，rTMS对学习记忆的影响机制有待于更多、更深入的研究。

【】
  ［1］Lisanby SH, Belmaker RH. Animal Models of the Mechanisms of Action of Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation(rTMS):Comparisons with Electroconvulsive Shock(ECS)［J］.Depression & Anxiety,2000,12（3）:178-187.

［2］Wassermann EM,Lisanby SH.Therapeutic Application of Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation:a Review［J］.Clin Neurophysiol,2001,112（8）:1 367-1 377.

［3］李葳，陈登榜，郑航，等.重复经颅磁刺激对Wistar大鼠行为影响的性别差异研究［J］.航天医学与医学工程，2006，19（1）:32-36.

［4］刘延友,杨波,江舟，等.不同光暗循环周期对小鼠学习记忆的影响［J］.航天医学与医学工程，2004, 17（5）: 381-382.

［5］王跃 ，周薇,刘延友，等.节律基因Period1对吗啡依赖效应的影响［J］.航天医学与医学工程，2004,17（5）:383-384.

［6］Testylier G,Tonduli L,Malabiau R,et al.Effects of Exposure to Low Lever Radiofrequency Fields on Acetylcholine Release in Hippocampus of Freely Moving Rats［J］.Bioelectromagnetics，2002,23（4）:249-255.

［7］杨学森,龚茜芬,张广斌，等.电磁辐射对大鼠学习记忆和海马神经元的影响［J］.解剖学研究,2004，26（2）:91-96.

［8］赵梅兰,马强,曹晓哲，等.电磁脉冲对大鼠学习记忆能力和长时程增强的影响［J］.中华物理医学与康复杂志,2001,23（2）:69-71.

［9］Boland A,Delapierre D.Effect of Intermittent and Continuous Exposure to Electromagnetic Fields on Cultured Hippocampus Cells［J］.Bioelectromagnetics，2002,23（2）:97-105.