Thapsigargin对人晶状体上皮细胞系SRA01/04增殖抑制的作用机制
作者：姬红培， 吴明星， 彭瑞萍
【摘要】 【目的】 研究thapsigargin（TG）对体外培养的人晶状体上皮细胞系SRA01/04增殖的影响，并探讨其分子机制。【方法】 不同浓度TG处理SRA01/04细胞72 h，噻唑蓝比色法（MTT）检测细胞增殖；流式细胞仪（PI法）检测细胞周期改变；透射电镜观察细胞超微结构变化；TUNEL法检测细胞核中DNA的断裂情况；激光共焦显微镜和流式细胞仪检测Caspase3活性亚单位（17/19 ku）的表达及阳性细胞表达率。【结果】 MTT法测得TG为0.325～5 μmol/L时，细胞增殖抑制率变化显著，IC50大约为0.8 μmol/L;透射电镜显示TG处理SRA01/04细胞膜皱缩，染色体浓缩、边集、核膜裂解、凋亡小体形成;流式细胞仪（PI法）及TUNEL法检测TG浓度为0，0.1，0.5，1，10 μmol/L分别处理SRA01/04细胞72 h，细胞凋亡率随浓度的增加而增加，呈浓度依赖性;TG处理后细胞Caspase3阳性表达率也呈浓度依赖性增加,TG为10 μmol/L时，几乎每个细胞浆内Caspase3都被激活。【结论】 Thapsigargin可能通过激活Caspase3为诱导体外培养的人晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞凋亡而抑制其增殖，TG为预防后发性白内障的药物研究提供了基础。
【关键词】 Thapsigarigin； 晶状体上皮细胞； 细胞凋亡； Caspase3
Effect and Mechanism of Thapsigargin on Proliferation of Human Lens
Abstract: 【Objective】 To investigate the effect of thapsigargin (TG) on the proliferation of human lens epithelial cells line SRA01/04 in vitro and underlay the molecular mechanism. 【Methods】 SRA01/04 cells were exposed to TG for 72 h, the drug-free medium was as control. Effect of TG on cell growth was assessed by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) assay. Ultrastructure was observed by transmission electron microscopy. DNA fragmentation was measured by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-nick end-labeling (TUNEL). Cell cycle analysis was determined by flow cytometry (FCM) with propidum iodine (PI) staining. Expression of cleaved caspase 3 protein was detected by confocal microscopy and flow cytometry. 【Results】 The growth of SRA01/04 cells were inhibited obviously by TG at concentration ranged from 0.325 to 5 μmol/L. The ultrastructure of treated SRA01/04 cells showed typically apoptotic characteristics, including chromatin condensation, chromatin crescent formation, nucleus fragmentation and apoptotic body formation. Exposed to 0, 0.1，0.5，1.0, 10 μmol/L TG for 72 h, the apoptotic rate by flow cytometry (PI means) and TUNEL were increased in a concentration-dependent manner. The expression of caspase3 was activated by TG，the cleaved caspase3 was expressed in a concentration dependent manner. The positive rate was about 100% at the concentration of 10 μmol/L. 【Conclusion】 The growth of SRA01/04 cells were inhibited by thapisigargin in a concentration dependent manner in vitro by inducing up-regulation of caspase 3 activation and starting apoptosis pathway. Thapisigargin may be developed as a potential therapeutic drug for posterior capsule opacification prevention.
后发性白内障是白内障术后影响视功能的严重的远期并发症之一，白内障术后残留的晶状体上皮细胞增殖、迁移、化生是其发生的病理基础[1]。目前手术中技术和人工晶状体的光学部设计等方面的改进使后发性白内障的发生率有所下降[2,3]，但白内障术后残留的晶状体上皮细胞的增殖仍是眼科界亟待解决的的难题。后发性白内障防治的关键是发现一种能有效抑制晶体上皮细胞增殖且无明显毒性作用的药物。Thapsigargin(TG)是上世纪70年代从草药Thapsia garganica根部所提取的一种蓓半萜内酯，特异性抑制细胞内质网钙泵[4]，破坏Ca2+的动态平衡，影响晶状体上皮细胞增殖等生物学功能[5，6]。我们将TG处理体外培养的人晶状体上皮SRA01/04细胞，研究TG能否抑制SRA01/04细胞的增殖，并探讨其分子机制，为药物防治后发性白内障提供新途径。
1 材料和方法
1．1 材 料
人晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞：由Ruddy实验室建立，美国Tuft大学的商福教授馈赠。主要试剂：Thapsigargin(TG)、Hoechst33342、MTT、PI、RNase A、多聚赖氨酸（均为美国Sigma公司产品）；cleaved caspase3抗体（cell signaling）；TUNEL试剂盒(南京凯基生物科技有限公司)；DMEM培养基、新生牛血清（美国Gibco公司产品）。主要仪器：CO2培养箱（美国SHELLAB公司）， CKX41型倒置显微镜（日本OLYMPUS公司），超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），LSM510型激光扫描共焦显微镜（德国Zeiss公司），荧光显微镜（德国Axioplan2 imaging），FACS Aria流式细胞仪（美国BD公司），H-600型透射显微镜（日本日立公司）。
1.2 方 法
1.2.1 细胞培养 用含10%新生牛血清，100 U/mL青链毒素的低糖DMEM培养基，置于5%CO2，37 ℃的细胞培养箱内培养。每次实验均取自同一批传代细胞。
1.2.2 噻唑蓝比色法 按每孔3×103细胞接种于96孔板，24 h后处理，每组5个复孔。MTT法检测吸光度（A值）。细胞相对生长抑制率=1-（实验组A值/对照组A值）×100%。
1.2.3 流式细胞仪检测 对数生长期细胞用含0.1，0.5，1.0，10 μmol/L TG培养液培养72 h，对照组加相同浓度的溶剂DMSO。收集细胞，70%乙醇固定，RNase A处理后PI染色，流式细胞仪检测PI荧光强度。
1.2.4 透射电镜 细胞消化传代，24 h后更换含1 μmol/L TG的完全培养液，对照组含相同浓度DMSO。培养72 h后常规固定、脱水、包埋、切片后透射显微镜观察。
1.2.5 TUNEL法标记凋亡细胞 对数生长期SRA01/04细胞按8 × 104个/张种植于22 mm×22 mm的多聚赖氨酸处理的盖玻片上，TG处理（方法同前）后，严格按照说明书进行操作。随机6个高倍视野中阳性细胞数及总的细胞数，核棕色为阳性结果。阴性组以PBS代替TdT酶，阳性对照以DNA酶I（DNase I,10 μg/mL）室温下处理10 min后再进行TUNEL操作，分别计算阳性率。
1.2.6 共聚焦显微镜 SRA01/04细胞处理同前，固定后一抗、二抗孵育，Hoechst 33342染色，激光共焦显微镜下观察。
1.2.7 流式细胞仪检测cleaved caspase3的表达 SRA01/04细胞处理后收集细胞固定，一抗、二抗孵育，以无细胞标本作为阴性对照，流式细胞仪分析阳性细胞表达率。
1.3 统计学分析
运用SPSS 13.0软件进行统计学分析，对不同浓度TG作用72 h后各组检测结果采用非参数检验方法（Kruskal-Wallis Test）和单因素方差分析（ANOVA），组间比较采用SNK （Student-Newman-Keuls）法，取?琢=0.05。
2 结 果
2.1 细胞生长曲线
当TG浓度为0.325～2.5 μmol/L时，细胞增殖抑制率变化显著，且呈剂量依赖性，IC50约为0.8 μmol/L(图1)。
2.2 细胞周期分布变化
流式细胞仪检测显示，正常组仅有正常的G1峰，未见亚二倍体峰；而TG处理组72 h的G1峰左侧出现亚二倍体峰型，且该峰在整个细胞周期中所占百分比例随着TG浓度的增加而增加，具有浓度依赖性。统计采用 ANOVA 法，F =9412.58，P﹤0.05。各组间比较均有显著性差异（P﹤0.01，图2）。
2.3 细胞超微结构的改变
TG处理组中细胞的胞浆发生浓缩，胞核内染色质浓集、贴边聚集在核膜周围、染色质形成新月体样变化和凋形成亡小体等典型的细胞凋亡改变的特征（图3）。
2.4 细胞原位凋亡标记
原位末端标记的SRA01/04细胞中，细胞核内存在棕黄色/棕褐色的颗粒状沉淀，形状不一，有的核全染，有的染成新月状，有的呈点状。在正常对照组，TUNEL阳性颗粒非常少见，而随着TG浓度的增加，TUNEL阳性细胞所占百比例随着增加，呈浓度依赖性（图4）。
2.5 Capase3活性亚单位的阳性表达
美国cell signaling公司最新生产的兔抗人cleaved Caspase3抗体能特异性检测Caspase3的17/19 ku活性亚单位，而对完整的Caspase3及其它Caspases的活性片段无免疫反应。细胞核（Hoechst 33342，蓝色荧光）体积变小或者形成凋亡小体等具有凋亡特征的细胞的胞浆内出现点状或者弥漫性cleaved Caspase3免疫反应阳性荧光（FITC，绿色荧光），而细胞核形态完全正常者则表现为cleaved Caspase3免疫反应阴性（图5）。
该结果证实了Caspase3只在细胞凋亡时被激活理论，同时也说明TG可能通过Caspase家族诱导人SRA01/04细胞凋亡，区别于少数非Caspase家族凋亡途径。
另一方面流式细胞仪检测cleaved Caspase3细胞阳性表达率的结果显示：随着TG浓度的增加，cleaved Caspase3细胞阳性表达率明显增加，且呈剂量依赖性，当TG为10 μmol/L，几乎为100%（图6）。统计分析采用ANOVA，F=127.779，P﹤0.001。除0.1 μmol/L及0.5 μmol/L组无显著性差异（P=0.140），其余各组间比较均有显著性差异（P﹤0.01）。
3 讨 论
3.1 TG诱导人晶状体上皮细胞系SRA01/04凋亡
TG抑制SRA01/04细胞的增殖，MTT法检测IC50大约为0.8 μmol/L。流式细胞仪检测结果显示处理组在细胞周期的G1峰前出现亚G1峰,且该峰在细胞周期中所占的百分比随着TG浓度的增加而增加；透射电镜进一步地证实了细胞的超微结构发生了改变：细胞膜皱缩；染色体浓缩、边集，凋亡小体形成，这些结果均表明TG诱导了SRA01/04细胞凋亡。TUNEL法检测细胞凋亡比例也随着TG浓度的增加而增加,呈浓度依赖性。因此，TG是通过诱导细胞凋亡而抑制SRA01/04细胞增殖的。
3.2 TG剂量依赖性激活Caspase3
哺乳动物细胞的程序性死亡是在一定条件下诱导的通过一系列信号级联转导的有秩序的死亡过程。除少数细胞经非Caspase依赖途径凋亡,大多数细胞是经Caspase依赖途径凋亡。Caspase级联系统在凋亡诱导过程中扮演了极其重要的角色，而在Caspase级联信号传导过程中，Caspase3（又称CPP32, TAMA, apopain）目前被普遍认为是Caspase家族中效应Caspase蛋白，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路和关键的调节点[7]。在原核细胞中，凋亡效应蛋白编码基因包括CSP-1和CSP-2，果蝇属则包括DRICE，DCP-1，DECAY，DATDREAM，它们和哺乳动物的Caspase3的基因编码存在极其相似的同源保守序列。
Caspase3在正常情况下以无活性的酶原形式（分子量31594 u）存在于细胞质内，当细胞凋亡时被激活，形成大（17 ku）小（12 ku）两个活性片段从而发挥生物学功能[7]。共聚焦显微镜和流式细胞仪的结果与目前认为的凋亡与Caspase3之间的相关性是一致的[8，9]。这些结果更进一步地说明TG诱导SRA01/04细胞凋亡，另一方面也说明了细胞是经Caspases途径凋亡。
目前普遍接受的观点认为，凋亡具有三种途径：细胞膜死亡受体途径、线粒体途径、内质网应激途径，其中内质网应激途径受到越来越多的关注。而20世纪90年代初，Thastrup和Sabala就分别提出，TG是一种内质网/肌浆网上Ca2+-ATPase的抑制剂，从而对胞内Ca2+信号进行调节[10，11]。所以我们推测Caspase3的激活可能是由于TG抑制SRA01/04细胞内质网Ca2+-ATPase，破坏内质网内Ca2+动态平衡，造成内质网应激，激活上游的Caspases，如Caspase12等。Caspase3的激活导致细胞呈现典型细胞凋亡形态学改变。可以想象，如果在白内障术采用TG处理的人工晶体可能对超声乳化联合人工晶体植入术后晶状体上皮细胞的增殖起到抑制作用，TG有可能成为防治后发性白内障的临床应用的药物。
无论在生理状态、白内障试验模型以及白内障患者，中央与周边区域的晶状体上皮细胞生长特性都存在差异，因此相应的增殖能力不同[12]。在高糖环境下LEC增殖能力不同程度的受到影响，可能与糖性白内障的发生有一定的关系[13]。然而有关晶体上皮细胞的一系列研究都最终指向了如何抑制其增殖活性这一方向。本研究发现, TG明显抑制晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞的增殖,且其抑制增殖机制有可能是激活Caspase3，通过Caspase家族级联系统诱导体外培养的人晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞凋亡而产生的。本研究结果为进一步应用TG进行后发性白内障药物防治的动物实验研究提供依据。
【】
PANDEY S K, APPLE D J, WERNER L, et al. Posterior capsule opacification: A review of the aetiopathogenesis, experimental and clinical studies and factors for prevention [J]. Indian J Opthalmol, 2004， 52(2):99-112.
DEWEY S. Posterior capsule opacification [J]. Curr Opin Ophthalmol， 2006，17(1): 45-53.
AUFFARTH G U, RABSILBER T M, REULAND A J. New method for the prevention of posterior capsule opacification [J]. Ophthalmologe， 2005， 102(6): 579-586.
OHATA H, TANAKA K, AIZAWA H, et al. Lysophosphatidic acid sensitises Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in cultured lens epithelial cells [J]. Cell Signal, 1997，9: 609-616.
WILLIAMS M R, et al. Calcium mobilisation modulates growth of lens cells [J]. Cell Calcium, 1996，19(8):83-89.
KARLSSON J O, ANDERSSON M, KLING-PETERSEN A, et al. Proteolysis in human lens epithelium determined by a cell-permeable substrate [J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1999， 40(9): 261-264.
GUPTA S, KNOWLTON A A. HSP 60, Bax, Apoptosis and the Heart [J]. J. Cell Mol Med, 2005， 9(3): 51-58.
YANG L Q, FANG D C, WANG R Q. Effect of NF-κB, survvin, Bcl-2 and Caspase3 on apoptosis of gastric cancer cells induced by tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand [J]. World J Gasreonenterol, 2004, 10(1): 22-25.
张振雨，叶伟，黄东生，等. 兔软骨终板细胞凋亡与Caspase-3和Fas表达的实验研究 ［J］. 临床解剖学杂志， 2006，24（5）：553-556.
THASTRUP O. Role of Ca2+-ATPases in regulation of cellular Ca2+ signaling, as studied with the selective microsomal Ca2+-ATPase inhibitor, thapsigargin [J]. Agents Actions, 1990, 29(1-2): 8-15.
SABALA P, CZATNY M, WORONCZAK J P, WORNCZAK J P. Thapsigargin: potent inhibitor of Ca2+ transport ATP-ases of endoplasmic and sarcoplasmic reticulum [J]. Acta Biochim Pol, 1993, 40(3): 309-19.
马 璇，吴明星，张艳丽. 不同区域晶状体上皮细胞基因表达差异分析 [J]. 中山大学学报:医学版, 2006, 27(5):553-561.
李 霞，刘奕志，吴明星. 高糖对人晶状体上皮细胞缝隙连接细胞间通讯的影响 [J]. 中山大学学报:医学科学版, 2005, 26(3):257-259.
