蛋白酶体β5亚单位过表达对氧化环境下人晶状体上皮细胞的影响
作者：张铁英， 柳夏林， 吴明星， 刘奕志
【摘要】 【目的】 探讨蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)基因过表达对氧化条件下晶状体上皮细胞的影响。【方法】构建重组质粒pcDNA3.1－PSMB5并将其转染入人晶状体上皮细胞株SRA01/04中，形成稳定表达，同时设pcDNA3.1空载体为对照组。RT-PCR法及Western blot法分别检测PSMB5基因及蛋白的表达情况。H2O2分别作用PSMB5转染细胞及空载体转染细胞，MTT法检测细胞增殖能力的变化。【结果】 转染后用G418筛选3周后，获得PSMB5转染及空载体转染的G418抗性的细胞克隆。转染PSMB5基因的细胞PSMB5 mRNA表达强度明显增高，而空载体转染细胞与未转染细胞无显著差异；转染PSMB5基因的细胞的PSMB5蛋白表达也显著高于空载体转染细胞。低浓度H2O2作用后，转染PSMB5基因的细胞增殖能力高于空载体转染细胞。【结论】低浓度氧化环境下蛋白酶体β5亚单位PSMB5过表达能对人晶状体上皮细胞具有保护作用。
【关键词】 过表达； 蛋白酶体； PSMB5； 晶状体； 增殖
Abstract: 【Objective】 To explore the influence of proteasome subunit β5 (PSMB5) gene overexpression in human lens epithelial cells under the oxidative condition. 【Methods】 The recombinant plasmid pcDNA3.1-PSMB5 was constructed and transfected into human lens epithelial cell line SRA01/04 to form stable transfection, and empty pcDNA3.1 was also transfected into lens epithelial cells at the same time as control. RT-PCR and Western blot analysis were performed to detect the PSMB5 gene and protein expression. Cell viability assay was performed using 3-[4,5dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide substrate (MTT) after the above cells were treated by H2O2. 【Results】 The G-418-resistant cell clones, which had been transfected with PSMB5 or empty vector were obtained by screening continually with G-418 for 3 w after transfection. There was stronger expression of PSMB5 mRNA in the cells transfected with PSMB5 gene than in those transfected with empty vector or non-transfected cells; the expression of PSMB5 protein was also significantly upregulated in PSMB5 transfected cells than in empty vector transfected cells. Cell viability of PSMB5 transfected cells was statistically higher than that of empty-transfected cells under the low H2O2 concentration.【Conclusion】Overexpression of the proteasome β5 catalytic subunit can play protective role to human lens epithelial cells under the low oxidative environment.
Key words: overexpression; proteasome; PSMB5; lens; viability
白内障是全球最主要的致盲眼病，其发病机理仍不清楚。目前普遍认为氧化损伤是年龄相关性白内障形成中的重要因素，并且在体内、外实验中得到证实。氧自由基使晶状体内的蛋白质受到损伤，这些异常蛋白质蓄积会导致细胞的功能异常。蛋白酶体作为细胞内蛋白质降解的主要途径之一，能够有效地清除晶状体内异常的蛋白质，维持晶状体的透明性[1]。位于蛋白酶体核心部分20S的β5亚单位（beta 5 subunit of proteasome, PSMB5）具有糜蛋白酶样酶活性，是蛋白酶体所具有的三大主要的酶活性之一[2]。蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的重要途径之一，而PSMB5在降解蛋白质过程中发挥重要的蛋白水解酶的作用。已有研究证实，在年龄相关性白内障等疾病中，蛋白酶体的蛋白水解酶功能均不同程度降低 [3]。氧自由基，特别是H2O2能明显抑制蛋白酶体的活性[4]，最近的研究表明氧化损伤对蛋白酶体亚单位的表达有抑制作用[5] 。我们用基因转染技术将含有PSMB5基因的真核表达载体转入人晶状体上皮细胞系SRA01/04内，建立稳定高表达PSMB5蛋白的晶状体上皮细胞，并用H2O2进行处理，分析PSMB5蛋白对晶状体上皮细胞的影响，为年龄相关性白内障的发病机制及防治方法提供依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
人晶状体上皮细胞株SRA01/04、大肠杆菌菌株DH5α及真核表达载体pcDNA-3.1由本实验室保存；新生牛血清及DMEM培养基（Gibco公司）；引物合成（北京赛百盛公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司），全自动测序由Invitrogen公司完成；限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ及T4连接酶（TaKaRa公司）；牛小肠碱性磷酸酶（BCIP，上海生工生物工程服务有限公司）；RT-PCR试剂（TOYOBO公司）；质粒提取试剂盒及脂质体SuperFect（QIAGEN）。
1.2 PSMB5真核表达载体的构建
根据GeneBank的PSMB5基因序列设计上下游引物，在其两端分别加入HindⅢ及EcoRⅠ的酶切位点序列。F：5′-GCGAAGCTTATGGCGCTT GCCAGCGTGT-3′，R：5′-AGAGAATTCTCAG GGGGTAGAGCCACTAT-3′。从人晶状体上皮细胞株SRA01/04中提取总RNA，RT-PCR扩增目的DNA片段，凝胶回收目的片段。HindⅢ及EcoRⅠ双酶切质粒pcDNA3.1(+)和回收的目的DNA片段，T4连接酶进行连接，构建重组质粒，进行筛选和鉴定。
1.3 重组质粒PSMB5-pcDNA3.1的转染及筛选
15％新生牛血清的DMEM培养液培养人晶状体上皮细胞株SRA01/04 ，使细胞处于对数生长期。取适当数量的细胞接种于6孔板中，当细胞生长融合至60%~70％，将5 μg纯化的质粒DNA溶于50 μL 无血清的DMEM，加入30 μL转染试剂混匀，室温下孵育。PBS洗细胞3次，加入转染混合液。37 ℃，5％CO2条件下培养3 h，弃去转染混合液，加入2 mL含15％血清的DMEM 培养液继续培养。转染48 h后，培养液中加入终浓度为700 μg/mL 的G418进行筛选，3～4个星期后选取阳性细胞继续培养。
1.4 RT-PCR检测PSMB5的表达
稳定转染的细胞吸去培养液后，用冰预冷的PBS 洗3次，加入1 mL Trizol，氯仿、异丙醇提取RNA，测定浓度。逆转录反应： 5×RT缓冲液4 μL，dNTP混合物2 μL，RNA酶抑制剂1 μL，OligodT 1 μL，RNA 2 μL，逆转录酶1 μL，加DEPC处理水至总体积20 μL。反应混合物于30 ℃水浴中孵育10 min，42 ℃水浴孵育20 min，99 ℃灭活逆转录酶5 min，-20 ℃保存。PCR扩增：引物稀释至浓度为10 pmol/μL。反应体系为：10×PCR缓冲液5 μL， dNTP 5 μL， MgSO4 3 μL，上下游引物各1 μL（或β-actin上下游引物各1 μL），cDNA 1 μL，DNA多聚酶1 μL，加高压灭菌的去离子水至总体积50 μL。PCR循环过程：预变性94 ℃ 4 min，变性94 ℃ 30 s，复性57 ℃ 30 s， 延伸68 ℃ 50 s，35个循环，终末延伸68 ℃ 10 min。β－actin作为内参。取3 μL扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，凝胶图像分析仪处理。
1.5 Western Blot法检测蛋白酶体亚单位的表达
稳定转染的晶状体上皮细胞，用冷PBS洗3次，加入100 μL细胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, 1%NP-40, 0.1%SDS，1 mmol/L 苯甲基磺酰氟)，冰上放置30 min，用刮器刮取，4 ℃、12 000 r/min（r=8.3 cm）离心20 min（Eppendorf 5415R），收集上清，测定提取的总蛋白浓度，-20 ℃保存。制备的蛋白样品进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转膜法将蛋白转到硝酸纤维素膜上，5％脱脂牛奶封闭1 h后，一抗4 ℃孵育过夜，三羟甲基氨基甲烷缓冲液冲洗后加入辣根过氧化物酶标记的特异性二抗室温孵育1 h，加底物显色。
1.6 MTT法检测细胞增殖能力
将细胞以适当密度接种于96孔板中，37 ℃，5%CO2培养24 h。弃去培养液，每组细胞加不含酚红和血清的不同浓度的H2O2 180 μL处理，每组浓度做5个复孔，并设正常对照组。5%CO2培养4 h。加MTT （5 mg/mL）：每孔20 μL，继续培养4 h。吸除孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO，震荡5~10 min。在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度。1.7 统计学分析
各组数值用ｘ±ｓ表示，应用 SPSS 11.5软件，采用ANOVA检验统计结果，取?琢=0.05。
2 结 果
2.1 PSMB5的PCR结果
目的基因PSMB5扩增后于10 g/L琼脂糖电泳,根据所设计的PSMB5基因的PCR引物可知目的基因大小约为792 bp，电泳后获得的片段与预计相符（图1）。
2.2 重组质粒的鉴定结果
以重组质粒为模板PCR扩增，琼脂糖电泳可见一约792 bp条带。重组质粒经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后电泳，可见一约792 bp条带，与预计相符（图2）。
2.3 pcDNA3.1－PSMB5基因测序结果
重组质粒pcDNA3.1－PSMB5由Invitrogen公司进行基因测序，结果显示，各连接位点正确，表达框架与已知相符。
2.4 半定量RT-PCR结果
分别提取为未转染组、空载体pcDNA3.1组及PSMB5转染组细胞的总RNA，做RT-PCR，结果如图3。转染组PSMB5基因的mRNA明显高于其他组（图3）。
2.5 Western blot 检测蛋白表达结果
分别提取空载体转染细胞及PSMB5转染细胞的蛋白，Western blot检测PSMB5蛋白表达情况，结果如图4。PSMB5转染细胞的蛋白酶体PSMB5亚单位蛋白表达明显高于空载体转染组。
2.6 H2O2对细胞增殖的影响
H2O2处理4 h后，PSMB5转染组及空转染组增殖受到抑制，而空转染组比PSMB5转染组降低更为明显，统计学具有显著性差异。
3 讨 论
蛋白酶体系统是由泛素、蛋白酶体以及介导泛素和蛋白酶体相互作用的酶类组成，主要具有糜蛋白酶样、胰蛋白酶样、天冬氨酸特异性蛋白水解酶样三种蛋白酶活性，是细胞内蛋白降解的重要途径之一[6]。近年来的研究表明，泛素－蛋白酶体途径参与介导细胞活动过程，如：细胞周期的进展、转录、凋亡、细胞生长、机体的发育等[7]，而在年龄相关性疾病、癌症、代谢性疾病以及炎症免疫过程中，泛素蛋白酶体途径起着重要作用[8，9]。
蛋白酶体β5亚单位PSMB5位于蛋白酶体的核心部分，具有糜蛋白酶活性，是蛋白酶体的主要酶活性之一。PSMB5在蛋白酶体的组装、成熟以及发挥蛋白水解功能中都起主导作用。研究结果提示，PSMB5亚单位通过其糜蛋白酶样酶活性降解异常氧化的蛋白质，防止这类蛋白质在晶状体内蓄积，从而对维持晶状体透明性发挥重要作用。
近年来的研究普遍认为氧化损伤是导致年龄相关性白内障发生的首要危险因素，各种原因和途径引起的氧自由基产生过多或清除减少，均可导致氧自由基在晶状体内蓄积。研究证实，晶状体混浊之前就己经有氧自由基造成的损伤，任何促使自由基产生增加的因素都能引起白内障形成。晶状体的上皮及晶状体纤维内都广泛存在着泛素－蛋白酶体系统[10]，能够有效地减少氧自由基造成的损伤，对晶状体具有保护作用，因此蛋白酶体对维持晶状体的透明性发挥着重要的作用，而蛋白酶体功能损伤与白内障形成密切相关。有研究表明人晶状体内蛋白酶体的三种酶活性随年龄增加都逐渐减低[11]，而在白内障晶体内蛋白酶体三种酶的活性较正常晶体内的蛋白酶体活性均明显降低[12]，白内障晶体的混浊程度也与蛋白酶体酶活性降低的程度明显相关。在氧化环境下，晶状体上皮细胞内蛋白酶体的活性明显受到抑制。由此我们推测，氧自由基造成的损伤抑制了蛋白酶体的保护功能，从而导致了白内障的形成，如果人为提高晶状体内蛋白酶体的功能，就可以增强晶状体防御氧化损伤的能力，从而延缓白内障的形成。
本研究构建了含有蛋白酶体PSMB5亚单位的重组真核表达质粒pcDNA3.1-PSMB5，并将其转染人晶状体上皮细胞系SRA01/04后，获得G418抗性细胞克隆，并采用RT-PCR及Western blot两种方法检测证实我们成功的使人晶状体上皮细胞系SRA01/04过表达PSMB5分子。本实验还检测了在H2O2处理的氧化环境下晶状体上皮细胞增殖能力的变化。研究结果提示，转染的晶状体上皮细胞和空载体转染的晶状体上皮细胞两组细胞的增殖能力逐渐下降，但是空载体转染细胞增殖能力受抑制程度更为明显。这表明PSMB5具有一定的抗氧化能力，对晶状体上皮细胞有保护作用。
本实验在体外成功模拟了晶状体上皮细胞中蛋白酶体PSMB5过表达，使蛋白酶体功能维持较高水平的状态，为研究氧化环境下蛋白酶体对晶状体上皮细胞的影响及其作用机制提供了良好的体外模型，并为深入研究蛋白酶体在年龄相关性白内障形成过程中的作用机制奠定了基础。
【】
ZETTERBERG M, PETERSEN A, SJOSTRAND J, et al. Proteasome activity in human lens nuclei and correlation with age, gender and severity of cataract[J]. Curr Eye Res, 2003, 27(1):45-53.
ORLOWSKI M, WILK S. Catalytic activities of the 20 S proteasome, a multicatalytic proteinase complexs [J]. Arch Biochem Biophy, 2000, 383(1):1-16.
JENNER P. Oxidative stress in Parkinson′s diseases[J]. Ann Neurol, 2003, 53 (Suppl 3）:S26-38.
REINHECKEL T, SITTE N, ULLRICH O, et al. Comparative resistance of the 20S and 26S proteasome to oxidative stress [J]. Biochem J, 1998, 335 ( Pt 3）:637-642.
HOSLER M R, WANG-SU S T, WAGNER B J. Targeted disruption of specific steps of the ubiquitin-proteasome pathway by oxidation in lens epithelial cells [J]. Int J Biochem Cell Biol, 2003, 35(5):685-697.
NANDI D, TAHILIANI P, KUMAR A, et al. The ubiquitin-proteasome system [J]. J Biosci, 2006, 31(1):137-155.
LIU Q, SHANG F, GUO W, et al. Regulation of the ubiquitin proteasome pathway in human lens epithelial cells during the cell cycle [J]. Exp Eye Res, 2004, 78(2):197-205.
QURESHI N, VOGEL S N, VAN WAY C 3rd, et al. The proteasome: a central regulator of inflammation and macrophage function[J]. Immunol Res, 2005, 31(3): 243-260.
杨艳艳，牛朝诗. 泛素蛋白酶体系统与帕金森病 ［J］． 中华神经医学杂志，2006，5（9）：962-965.
PEREIRA P, SHANG F, HO M, et al. Lens fibers have a fully functional ubiquitin-proteasome pathway [J]. Exp Eye Res, 2003, 76(5):623-631.
VITERI G, CARRARD G, BIRLOUEZ-ARAGON I, et al. Age-dependent protein modifications and declining proteasome activity in the human lens [J]. Arch Biochem Biophys, 2004, 427(2):197-203.
ANDERSSON M, SJOSTRAND J, KADSSON J O. Differential inhibition of three peptidase activities of the proteasome in human lens epithelium by heat and oxidation [J]. Exp Eye Res, 1999, 69(1):129-138.
