局灶性脑缺血再灌注损伤后杏仁核和海马环氧酶、脂氧酶及核因子?κB的表达

【摘要】  目的观察大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤(CIRI)后杏仁核和海马环氧酶?2(COX?2)、5?脂氧酶(5?LO)和核因子?κB(NF?κB)的表达情况,探讨其损伤机制。方法线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞2 h/再灌注24 h模型。免疫组织化学法检测杏仁核和海马COX?2、5?LO和NF?κB蛋白表达,计数COX?2、5?LO和NF?κB阳性细胞数,Motic Images Advanced 3.0图像分析系统作半定量分析。结果CIRI后大鼠杏仁核和海马COX?2、5?LO和NF?κB阳性细胞计数明显增高(P<0.001),平均灰度值显著下降,表达增强(P<0.001)。结论CIRI后大鼠杏仁核和海马区域的COX?2、5?LO和NF?κB表达增强,继而引发后续反应,介导神经损伤。

【关键词】  脑缺血 再灌注损伤 杏仁核 海马 环氧水解酶类

    杏仁核和海马是边缘系统的重要核团,它们之间不仅解剖位置紧临,其关系也很密切。目前对海马在脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)中神经细胞的凋亡情况已有报道[1]。本课题组既往的研究表明,局灶性CIRI后大鼠杏仁核出现缺血坏死、水肿,正常锥体神经元密度减少[2],其机制可能与MMP9、AQP4表达增加有关。笔者从花生四烯酸(arachidonic acid,AA)代谢通路主要限速酶——环氧酶?2(cyclooxygenase?2,COX?2)和5?脂氧酶(5?lipoxygenase,5?LO)在CIRI中的活化,以及核因子?κB(nuclear factor?kappa B,NF?κB)介导神经细胞损伤的角度,研究局灶性CIRI后大鼠杏仁核和海马COX?2、5?LO和NF?κB的表达情况,以期进一步探讨杏仁核和海马在CIRI中的损伤机制。

    1材料与方法

    1.1材料

    1.1.1动物Sprague?Dawley大鼠,雄性,体质量(250±25)g,福建医科大学实验动物中心提供(合格证号:闽实动质准第002?05号)。术前12 h禁食,自由饮水。

    1.1.2试剂和仪器光学显微镜及摄像系统(日本Olympus公司);Motic Images Advanced 3.0图像分析系统(香港麦克奥迪公司);5?LO、COX?2、NF?κB兔抗大鼠单克隆抗体(美国Cayman公司);SABC?兔IgG免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉Boster公司);枸橼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液(北京中山生物技术有限公司);其余试剂均为国产分析纯。

    1.2方法

    1.2.1模型制备SD大鼠随机分假手术组和模型组。模型组参照[3]线栓法制备右侧大脑中动脉栓塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型,假手术组不插入栓线,其他手术操作相同。

    1.2.2标本制作缺血2 h/再灌注24 h时,迅速断头取脑,去除小脑及嗅球,取视交叉至漏斗柄的脑片置于4%甲醛溶液中固定>1周,常规脱水、透明、浸蜡、包埋,冠状切片5 μm,贴于多聚赖氨酸处理的载玻片上,免疫组织化学染色,观察各指标。

    1.2.3COX?2、5?LO和NF?κB蛋白在杏仁核和海马的表达免疫组织化学SABC法分别检测损伤侧杏仁核和海马COX?2、5?LO和NF?κB的蛋白表达,均按试剂盒说明书逐项操作,室温显色。于10×40视野下随机选取相应区域5个不重叠视野进行阳性细胞计数,COX?2、5?LO阳性细胞的细胞质呈棕黄色,核淡染;NF?κB阳性细胞的细胞质呈棕黄色,核深染。应用Motic Images Advanced 3.0图像分析系统行半定量分析,阳性细胞的平均灰度值。

    1.3统计学处理采用SPSS 13.0软件进行统计分析,实验数据以x±s表示,各参数间的比较采用t检验。

    2结果

A:假手术组; B:杏仁核; C:海马.COX?2:环氧酶?2； 5?LO：5?脂氧酶；NF?κB：核因子?κB.

    图1损伤侧杏仁核和海马环氧酶?2、5?脂氧酶和核因子?κB蛋白的表达(×400)

    Fig 1The changes of COX?2,5?LO and NF?κB proteins in amygdale and hippocampus of the injured brain tissue(×400)2.1COX?2的表达假手术组脑组织基本没有COX?2阳性细胞的表达,杏仁核和海马未见阳性细胞表达;模型组杏仁核和海马见大量COX?2阳性细胞(图1),杏仁核区阳性细胞为(28.8±3.2),海马区为(30.4±2.9),且平均灰度值均明显下降,提示模型组杏仁核和海马COX?2的表达增强(P<0.001,图2,3)。

    2.25?LO的表达假手术组脑组织仅有少量5?LO阳性细胞表达,杏仁核和海马未见阳性细胞表达;模型组杏仁核区阳性细胞为(30.7±3.0),海马区为(32.8±3.5),两区域阳性细胞表达数明显增多(P<0.001,图1),平均灰度值下降,5?LO表达增强(图2,3)。

    2.3NF?κB的表达假手术组脑组织与杏仁核和海马区域仅见少量NF?κB阳性细胞;模型组杏仁核区阳性细胞为(27.9±1.3),海马区为(25.4±0.9),两核团阳性细胞数明显增多(P<0.001,图1),平均灰度值下降,NF?κB表达增强(图2,3)。

    COX?2:环氧酶?2； 5?LO：5?脂氧酶； NF?κB：核因子?κB.与假手术组比较,☆:P<0.001.

    图2杏仁核环氧酶?2、5?脂氧酶和核因子?κB蛋白表达的比较

    Fig 2The changes of the expression of COX?2,5?LO and NF?κB proteins in amygdale福建医科大学学报2007年5月第41卷第3期郑祥等：局灶性脑缺血再灌注损伤后杏仁核和海马环氧酶?2、5?脂氧酶及核因子?κB的表达COX?2：环氧酶?2； 5?LO：5?脂氧酶； NF?κB：核因子?κB.与假手术组比较,☆:P<0.001.

    图3海马环氧酶?2、5?脂氧酶和核因子?κB蛋白灰度值比较

    Fig 3The changes of the expression of COX?2,5?LO and NF?κB proteins in hippocampus

    3讨论

    研究证明,大鼠局灶性CIRI后,海马CA1区神经细胞凋亡明显增加,以抗凋亡药物干预可有效减轻CA1区的损伤[4]。Zhang等在大鼠低温心肺分流模型中发现海马CA1区在心肺分流后凋亡相关基因活性增强,并出现神经细胞凋亡[5]。笔者既往已证实局灶性CIRI后大鼠杏仁核可见缺血坏死、水肿,正常锥体神经元密度减少[2],可见CIRI后海马和杏仁核确实出现了神经细胞损伤。本实验进一步发现局灶性CIRI后海马和杏仁核均有COX?2、5?LO和NF?κB的大量表达。由于COX?2和5?LO为AA代谢通路中主要的的限速酶，AA经由这两条途径代谢后,一方面产生氧源性自由基,另一方面经COX?2和LO催化产生前列腺素、血栓素、白三烯等脂质炎症介质,此为引起CIRI的重要因素[6?7]。NF?κB为即早基因家族,在脑缺血损伤初期即有NF?κB的激活。活化的NF?κB可以进入细胞核,并可以调控COX?2和5?LO等成分的转录[8],引发后续的神经损伤。

    3.1CIRI后杏仁核和海马COX?2高表达的损伤作用CIRI后杏仁核和海马神经突触活动增强,激活谷氨酸受体,COX?2表达上调,反应产物增多。本实验发现CIRI后COX?2的表达增强,主要分布在杏仁核、海马和皮质区。COX?2的高表达使其反应产物PGE2增加，PGE2一方面可增强N?甲基?D天冬氨酸介导的神经毒性作用而引起脑损伤[9],并使谷氨酰胺释放增加,进一步导致AA释放增多,AA在代谢过程中伴有氧自由基生成增多,使脑组织脂质过氧化,加重脑损伤[10],另一方面以时间依赖方式激活caspase?3,诱导神经细胞凋亡。本实验中假手术组的杏仁核和海马区域则仅有极少量的COX?2表达。笔者已证实选择性COX?2抑制剂可有效减少CIRI后的神经细胞凋亡[6],由此可见CIRI后COX?2的高表达确实导致了杏仁核和海马区的神经损伤。

    3.2CIRI后杏仁核和海马5?LO高表达的损伤作用本实验证实CIRI后大鼠杏仁核和海马5?LO的活性增强。5?LO的活性增强可大量催化AA生成白三烯，后者可介导炎症,诱导平滑肌收缩、微血管渗漏等。白三烯还可促进N?甲基?D天冬氨酸介导的神经毒性作用[11];引发过氧化反应而产生大量氧自由基,使细胞膜脂质过氧化以及与血管平滑肌细胞产生反应,使血管痉挛,血脑屏障开放,并导致脑水肿[12]。本实验观察发现，CIRI后杏仁核、海马的5?LO的活性比假手术组明显增高(P<0.001),笔者既往也发现CIRI后5?LO表达增高的区域伴随出现神经细胞的损伤、脑水肿等。5?LO抑制剂可有效减轻神经细胞损伤[7],提示5?LO在CIRI后杏仁核和海马区神经损伤中起了重要的作用。

    3.3CIRI后杏仁核和海马NF?κB高表达的损伤作用CIRI后机体经受缺氧/复氧刺激,杏仁核和海马区域的NF?κB被激活,并迅速移位入胞核,其DNA结合活性呈倍数增加。Nurmi等研究大鼠局灶性脑缺血模型时发现缺血24 h后脑组织中NF?κB的转录活性增加了260%[13]。本实验也发现在CIRI后大鼠杏仁核和海马NF?κB阳性的细胞比假手术组明显增多(P<0.001)。NF?κB为即早基因,活化后可以影响COX?2和5?LO的转录,上调COX?2和5?LO的表达,继而加速AA代谢,引起杏仁核和海马的损伤。本实验结果提示NF?κB活化后可通过上调COX?2和5?LO的转录进一步加剧神经细胞的损伤。另有研究表明,NF?κB能促进诱导型一氧化氮合酶（iNOS)的表达,后者产生自由基又反过来激活NF?κB,从而使反应不断扩大[14]。在上述过程中均可产生大量自由基,对神经细胞造成损伤。NF?κB还可通过激活半胱氨酸蛋白激酶?3以及Fas配体介导神经细胞的凋亡。

    CIRI引起的神经细胞损伤机制十分复杂。笔者将在今后的研究中运用相关药物干预来观察COX?2、5?LO及NF?κB表达与神经细胞损伤的变化,以进一步了解CIRI后杏仁核和海马的损伤机制。

【】
  /[1/]Osamu M,Jinming P,Kazunori S,et al. Mechanisms of the anti?ischemic effect of vagus nerve stimulation in the gerbil hippocampus/[J/]. Clin Neurosc Neuropathol, 2003,14(15):1972?1974.

/[2/]叶薇,余涓,潘燕霞,等. 杏仁核和心肌在局灶性脑缺血再灌注损伤中的病理改变/[J/]. 福建医科大学学报, 2006,40(4):348?351.

/[3/]刘颖,余涓,许琳,等. 扎鲁司特对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用/[J/]. 临床药与学, 2006,11(4):436?439.

/[4/]李净,王健,韩小祥,等. 脑络欣通对脑缺血再灌注模型大鼠海马CA1区神经细胞凋亡的动态影响/[J/]. 中国中医药科技, 2006,13(4):222?223.

/[5/]Zhang T J,Hang J,Wen D X,et al. Hippocampus bcl?2 and bax expression and neuronal apoptosis after moderate hypothermic cardiopulmonary bypass in rats/[J/]. Cardiovasc Anesth, 2006,102:1108?1125.

/[6/]余涓,邱丽颖,周宇,等. 神经细胞凋亡及BCL?2、BAX蛋白表达在脑缺血再灌注损伤中的作用与罗非昔布的影响/[J/]. 中国药理学通报, 2005,21(5):572?575.

/[7/]许琳,余涓,刘颖,等. 5?脂氧合酶抑制剂zileuton对脑缺血再灌注损伤的保护作/[J/]. 中国药理学通报, 2006,22(7):853?855.

/[8/]Fahrig T,Gerlach I,Horvath E. A synthetic derivative of the natural product rocaglaol is a potent inhibitor of cytokine?mediated signaling and shows neuroprotective activity in vitro and in animal models of Parkinson’s disease and traumatic brain injury/[J/]. Mol Pharmacol, 2005,67(5):1544?1555.

/[9/]Iadecola C,Niwa K,Nogawa S,et al. Reduced susceptibility to ischemic brain injury and N?methyl?D?aspartate?mediated neurotoxicity in cyclooxygenase?2?deficient mice/[J/]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98(3):1294?1299.

/[10/]Dirnagl U,Iadecola C,Moskowitz M A,et al. Pathobiology of ischaemic stroke:an integrated view/[J/]. Trends Neurosci, 1999,22(9):391?397.

/[11/]Girard J,Panizzon K,Wallis R A. Azelastine protects against CA1 traumatic neuronal injury in the hippocampal slice/[J/]. Eur J Pharmacol, 1996,300(1?2):43?49.

/[12/]Di G A,Carnini C,Buccellati C, et al. Cysteinyl?leukotrienes receptor activation in brain inflammatory reactions and cerebral edema formation:a role for transcellular biosynthesis of cysteinyl?leukotrienes/[J/]. FASEBJ, 2004,18(7):842?844.

/[13/]Nurmi A,Lindsberg P J,Koistinaho M,et al. Nuclear factor?kappa B contributes to infarction after permanent focal ischemia/[J/]. Stroke, 2004,35(4):987?991.

/[14/]Kim E J,Kwon K J,Park J Y,et al. Effects of peroxisome proliferator?activated receptor agonists on IPS?induced neuronal death in mixed cortical neurons:associated with iNOS and COX?2/[J/]. Brain Res, 2002,941(1?2):1?10.