姜黄素与STI571联合及序贯给药对K562细胞增殖的影响

【摘要】  目的研究姜黄素(Cur)与STI571联合应用对慢性粒细胞白血病(CML)细胞株K562增殖的影响,探索两药序贯给药的不同效果。方法锥虫蓝排染计数K562细胞增殖抑制率;显微镜下观察Cur与STI571联合应用对K562细胞的细胞毒作用;锥虫蓝排染法检测药物序贯给药的不同效果;金氏公式评价两药的协同效果。结果Cur与STI571单独作用均抑制K562细胞的增殖,二者联合应用呈协同作用(Q>1.15);显微镜下可见0.4 μmol/L STI571与 5 μmol/L Cur联合应用对K562细胞毒作用强于单独应用;先给予STI571作用24 h,再给予Cur作用24 h,对K562细胞的抑制呈协同作用(Q>1.15),而先给予Cur作用24 h,再给予STI571作用24 h,则呈单独相加或拮抗作用(Q<1.15)。结论Cur与不同浓度的STI571(0.1~0.4 μmol/L)联合应用可协同抑制K562细胞增殖;联合应用STI571和Cur时,先给予STI571再给予Cur比先给予Cur再给予STI571协同效果好。

【关键词】  中草药 姜黄素 K562细胞 白血病 髓样 慢性 药物疗法,联合

    慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是以费城染色体(Ph)为特征的多潜能干细胞异常的骨髓恶性增殖性疾病。在我国,CML约占各类白血病的15%~20%,仅次于急性粒细胞白血病(AML)和淋巴细胞性白血病(ALL),占慢性白血病的95%[1]。目前针对该病的发病特点所研制的STI571(Gleeve,CGP57148B,imatinib mesylate),具有独特的作用机制和高效的特异性,在临床上被广泛应用。但是,随着该药的广泛应用,其不良反应及耐药问题相继出现。因此,协同用药成为目前研究STI571的一大热点。姜黄素(curcumin,Cur)具有抗肿瘤、抗炎、抗血小板聚集等广泛的药理作用及毒性小等特点[2?3],与较小剂量STI571(0.1~0.15 μmol/L)联合应用对抑制K562细胞增殖呈单独相加,而与较大剂量STI571(0.2~0.8 μmol/L)可明显协同下调P210bcr/abl和PKC的表达水平[4]。笔者进一步探讨不同剂量的STI571与Cur联合应用对K562细胞增殖的影响及序贯给药产生的不同效果。

    1材料与方法

    1.1材料

    1.1.1药品与试剂姜黄素(上海试剂三厂,批号980825),纯度99%,溶解于二甲基亚砜(DMSO),配成20 mmol/L储存液于-20 ℃储存备用。STI571(瑞士诺华公司)经本研究所萃取、重结晶所得,纯度99%,溶解于DMSO,配成10 mmol/L,于-20 ℃储存备用。

    1.1.2细胞株及培养条件人CML细胞株K562(院上海细胞研究所),培养于含10%小牛血清、1×108 U/L青霉素及100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养液,在37 ℃、体积分数为0.05的CO2中培养。细胞接种24 h后进入指数增长期。

    1.2方法

    1.2.1Cur和/或STI571对K562细胞的影响取指数增长期的K562细胞100 μL[(2~4)×109L-1]加入96孔板中,每个加药组设3个复孔,分别设空白组,Cur 2.5,5,10,20 μmol/L,STI571 0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2 μmol/L的单独作用浓度以及STI571 0.1,0.2,0.4 μmol/L与Cur 5 μmol/L联合作用浓度,给药后各孔终体积相同。将培养板置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养,24 h后用锥虫蓝排染计数，计算抑制率。

    抑制率=[(空白组-实验组)/空白组]×100%

    1.2.2Cur和/或STI571对K562细胞的细胞毒作用取指数增长期的K562细胞100 μL[(2~4)×109L-1]加入96孔板中,每个加药组设3个复孔,分别设空白组,Cur 5 μmol/L,STI571 0.4 μmol/L单独作用浓度以及二者联合作用浓度,给药后各孔终体积相同。将培养板置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养,24 h后显微镜下观察细胞的存活情况。

    1.2.3序贯给药取指数增长期的K562细胞100 μL[(2~4)×109L-1]加入96孔板中,每个加药浓度设3个复孔,分别设空白、Cur 5,10 μmol/L、STI571 0.05,0.1,0.2,0.4 μmol/L的给药浓度，给药后各孔终体积相同。药物联合作用观察:细胞先给予STI571 0.05,0.1,0.2 μmol/L作用24 h,然后给予不同浓度Cur作用24 h;以及细胞先给予不同浓度Cur作用24 h,再给予STI571 0.1,0.2,0.4 μmol/L作用24 h。将培养板置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养,待药物作用时间结束用锥虫蓝排染计数。

    1.3统计学处理数据用x±s表示,组间差异用t检验。计算两药联合应用时,用金氏公式求协同指数（Q值）[5]。

    2结果

    2.1Cur和/或STI571对K562细胞的影响药物作用后,锥虫蓝排染计数,Cur 2.5,5,10,20 μmol/L作用于K562细胞24 h后,细胞生长抑制率分别为3%,12%,61%和84%,呈量效关系(图1A)。不同浓度的STI571(0.1~3.2 μmol/L)作用24 h,K562细胞生长抑制率分别为12%,24%,54%,70%,90%和100%,呈量效关系(图1B)。不同浓度的STI571(0.1,0.2,0.4 μmol/L)和/或Cur 5 μmol/L对K562作用24 h。其中单独STI571 0.1,0.2,0.4 μmol/L对K562细胞的生长抑制率分别为12%,23%和54%;单独Cur 5 μmol/L对K562细胞的生长抑制率为12%;但二者联合应用后,细胞生长抑制率则分别提高到36%,54%和85%(图1C),Q值分别为1.62,1.64和1.48。Cur 5 μmol/L和不同浓度的STI571进行联合作用的Q值均>1.15(图1D)。

    2.2STI571和/或Cur对K562细胞的细胞毒作用单独给予STI571 0.4 μmol/L与Cur 5 μmol/L  24 h后,镜下可见少量活的K562细胞,细胞膜完整,光亮透明,部分细胞质饱满肿胀,可见细胞碎片以及形态不一的细胞。两药联合作用后,镜下罕见活细胞,可见较多的细胞坏死残片、颗粒等(图2)。

    2.3药物序贯给药的效果K562细胞先给予STI571 0.05,0.1,0.2 μmol/L作用24 h,再给予Cur 5,10 μmol/L作用24 h，两药联合作用的Q值均>1.15(表1);而先给予Cur 5,10 μmol/L作用24 h,再给予STI571 0.1,0.2，0.4 μmol/L作用24 h,Q值均<1.15(表2)。福建医科大学学报2007年5月第41卷第3期张昆仲等：姜黄素与STI571联合及序贯给药对K562细胞增殖的影响A:Cur对K562细胞的量效关系曲线; B:STI571对K562细胞的量效关系曲线; C:不同浓度STI571与Cur 5 μmol/L对K562细胞的作用; D:不同浓度STI571与Cur 5 μmol/L对K562细胞作用的协同指数.Cur:姜黄素.与空白组比较,☆:P<0.05; 与单独给予STI571比较,#:P<0.05.

     3讨论

    目前,STI571是临床上费城染色体阳性(Ph+)的慢性粒细胞白血病慢性期的首选药物,但是在临床广泛使用后出现了耐药现象。耐药性的产生主要是由于p210bcr/abl癌蛋白与STI571结合的部位发生点突变所致,其他尚有少量P210bcr/abl过量表达或不依赖P210bcr/abl等耐药病例[6]。STI571的耐药问题是该药在临床应用面临的一大难题,而探索解决其耐药问题是家研究的热点,目前普遍表1STI571和Cur序贯给药对K562细胞的协同效果

    Tab 1The sequential administration of STI571 alone or combined with Cur on K562 cellscSTI571μmol·L-1cCurμmol·L-1生长抑制率%Q值协同表2Cur和STI571序贯给药对K562细胞的协同效果

    Tab 2The sequential administration of Cur alone or combined with STI571 on K562 cellscCurμmol·L-1cSTI571μmol·L-1生长抑制率%Q值协同

    等级0060.67±5.6600.149.33±2.3900.224.50±0.8200.414.67±4.735040.17±5.941004.33±0.4750.141.50±2.040.68-50.223.50±0.700.84-50.47.17±1.541.05+100.15.00±2.160.97+100.23.17±0.850.98+100.41.00±0.821.00+Cur:姜黄素.

    认为,联合用药是减缓STI571耐药的主要策略。STI571和热休克蛋白90抑制剂格尔德霉素(GA)及低毒性的类似物17?烯丙氨格尔德霉素(17?AAG)、STI571和三氧化二砷、STI571和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HID)等均可有效诱导耐STI571的慢粒白血病细胞凋亡,但采取何种联合用药策略需根据对STI571产生耐药的机制而定[7?9]。本研究是利用传统中药姜黄中主要成分Cur进行研究。Cur对K562细胞的作用可能存在多靶点,即除了可下调P210bcr/abl外,还可作用于热休克蛋白家族90伴侣蛋白[10]。

    本实验结果表明,Cur可协同STI571抑制K562细胞的生长,这可能与其协同下调P210bcr/abl从而下调其下游的信号转导通路有关[4]。

    采取联合给药的方式也影响给药效果,本研究表明,对于K562细胞先给予STI571作用24 h再给予Cur作用24 h,效果优于先给予Cur作用24 h再给予STI571作用24 h。STI571是酪氨酸激酶抑制剂,本身对p210bcr/abl蛋白含量影响较小[11],其作用是由于占据了ABL激酶区域的ATP口袋,阻遏ATP与ABL结合,从而抑制其激酶活性,阻断其下游信号转导[12?13]。先给予STI571以后,药物抑制了酪氨酸激酶活性,此时再给予Cur,后者可能通过下调P210bcr/abl含量,影响P210bcr/abl激活的下游信号通路(如PKC等)而产生诱导CML细胞株凋亡,抑制细胞增殖,从而与STI571发挥协同抑制作用,即药物通过双层阻断而达到协同抑制K562细胞的作用。反之,先给予Cur作用24 h再给予STI571,药物的联合作用仅出现单独相加甚至拮抗,其机制可能是Cur不仅可以减少P210bcr/abl含量,还可以抑制酪氨酸激酶活性，Cur单独作用24 h后,可能与STI571竞争占据ABL激酶区域的ATP口袋,阻遏了ATP与ABL结合,因此出现单独相加或拮抗作用。有关机制尚待进一步探讨。

    Cur的研究近年来不断受到重视,尤其在抗癌方面。Cur和STI571联合应用,对K562细胞呈剂量依赖性的抑制作用,二者呈协同作用,先给予STI 571作用24 h,再联合应用Cur的协同效果更好。本实验为进一步研究Cur与STI571的联合应用提供实验室依据。

【】
  /[1/]O’Dwyer M E, Druker B J. Chronic myelogenous leukemia: new therapeutic principles/[J/]. J Intern Med, 2001,250(1):3?9.

/[2/]Ammon H P, Wahl M A. Pharmacology of curcuma longa/[J/]. Planta Med, 1991,57(1):1?7.

/[3/]Aggarwal B B, Kumar A, Bharti A C. Anticancer potential of curcuma: preclinical and clinical studies/[J/]. Anticancer Res, 2003,23(1A):363?398.

/[4/]张昆仲,许建华,黄秀旺,等. 姜黄素与STI571对慢性粒细胞白血病细胞株K562作用的体外研究/[J/]. 福建医科大学学报, 2006,40(5):427?430.

/[5/]金正均. 合并用药中的相加/[J/]. 药报, 1980,1(2):70?76.

/[6/]Corre M E,Mohammed M,Ellwood K,et al. Clinical resistance to STI?571 cancer therapy caused by BCR/ABL gene mutation or amplification/[J/]. Science, 2001, 293(5531):876?880.

/[7/]Blagosklonny M V,Fojo T,Bhalla K N,et al. The HSP90 inhibitor geldanamycin selectively sensitizes Bcr?Abl?expressing leukemia cells to cytotoxic chemotherapy/[J/]. Leukemia, 2001, 15(10):1537?1543.

/[8/]Perkins C,Kim C N,Fang G,et al. Arsenic induces apoptosis of multidrug?resistant human myeloid leukemia cells that express Bcr/Abl or overexpress MDR,MRP,Bcr?2,or Bcl?XI/[J/]. Blood, 2000, 95(3):1014?1022.

/[9/]Nimmanapalli R,Fuino L,Bali P,et al. Histone deacetylase inhibitor LAQ824 both lowers expression and promotes proteasomal degradation of Bcr?Abl and induces apoptosis of imatinib mesylate?sensitive or ?refractory chronic myelogenous leukemia?blast crisis cells/[J/]. Cancer Res, 2003,63(16):5126?5135.

/[10/]Zhang K Z,Xu J H,Huang X W,et al. Curcumin synergistically augments bcr/abl phosphorothioate antisense oligonucleotides to inhibit growth of chronic myelogenous leukemia cells/[J/]. Acta Pharmacologica Sinica, 2007, 28(1):105?110.

/[11/]Weisberg E,Griffin J D. Mechanism of resistance to the ABL tyrosine kinase inhibitor STI571 in BCR/ABL?transformed hematopoietic cell lines/[J/]. Blood, 2000,95(11):3498?3505.

/[12/]O'Dwyer M E,Mauro M J,Druker B J. Recent advancements in the treatment of chronic myelogenous leukemia/[J/]. Annul Rev Med, 2002,3:369?381.

/[13/]Deininger M W,Goldman J M,Melo J V. The molecular biology of chronic myeloid leukemia/[J/]. Blood, 2000,96(10):3343?3356.