小鼠锌指蛋白基因Znf230条件基因打靶载体的构建

             作者：刘英， 刘运强， 周钦， 陶大昌， 彭艳， 刘合

【关键词】  ,DNA结合基因蛋白质类；,基因；,聚合酶链反应；,克隆,分子

　　摘要:  目的  构建用于小鼠锌指蛋白基因Znf230条件基因打靶的载体，为产生Znf230基因敲除的小鼠模型准备条件。  方法  设计和合成引物，经PCR从小鼠的基因组中扩增出5′同源臂、3′同源臂及锚定序列，长度分别为4，4，1 kb的片段，反向插入pBS载体的neo基因的两侧，从而构建小鼠Znf230条件基因打靶载体Znf230pBS(5)。  结果  经过限制性内切酶及DNA测序鉴定，证实该条件基因打靶载体含有的同源序列与Genebank公布的基因序列一致，表明载体构建成功。  结论  PCR技术和定向克隆技术是构建条件基因打靶载体简单而可靠的方法。运用该技术可获得小鼠锌指蛋白基因Znf230的条件基因打靶载体。

　　关键词:  DNA结合基因蛋白质类； 基因； 聚合酶链反应； 克隆，分子

　　已婚育龄夫妇不孕不育症的发病率约10%～15%，其中50%由男性不育引起。导致男性不育的因素很多,除系统疾病、营养不良、内分泌疾病、精子运送的解剖学上障碍、感染、环境毒物等外，精子发生障碍为一个重要原因,表现为无精子症或少精子症(精子数<2×106 mL-1)。导致无精症的原因不详，更无有效的方法。为探讨其发病机制，了解疾病的干预因素，必须具有良好的动物模型。
   
　　基因打靶技术是近年来迅速起来的新兴分子生物学技术,对胚胎干细胞(embryonic stem,ES)进行基因打靶是人为特定地修饰和改造细胞染色体遗传性状的有效方法和途径[1]。Cre/LoxP系统的引入使从时间和空间控制基因的敲除成为可能，有效的避免了胚胎发育重要基因敲除后胚胎不能存活、从而无法进行后续研究的限制[23]。条件敲除载体的构建是进行条件基因打靶关键的第一步。一般使用替换型打靶载体,在锚定序列的两侧插入同向的LoxP序列和外源性同源序列及正筛选标志基因。正筛选标志基因位于内含子中，可以帮助研究者筛选接受了外源基因的细胞，但不影响细胞和整体的正常功能。笔者尝试运用该法建立Znf230基因敲除的小鼠模型，第一步工作就是利用Cre/LoxP系统构建条件基因打靶载体。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  限制性内切酶、T4DNA连接酶购自美国纽英伦公司；高保真Taq酶(Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity)和T载体(TOPO TA Cloning Kit)购自美国Invitrogene公司；pBlueScript 质粒购自美国STRATAGENE公司。胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)购自德国QIAGEN公司。质粒小量抽提试剂盒购自北京百泰克生物技术公司。所用引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成；测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

　　1.2  引物设计
   
　　F1：5′CAT ACG CGT GTT TGT TCT CTC TTT CCT TCC3′
   
　　R1：5′GCC GCT AGC CCT GTT ACA TAA CCA CAC TAG3′
   
　　用来扩增5′同源臂，并引入酶切位点MluⅠ和NheⅠ。
   
　　F2：5′CAT GAG CTC CTG AGC TTG GGT CTT CAT TCC3′
   
　　R2：5′CTG CAA TTG GTT GAG AAT CCA GAG GGA TGG3′
   
　　用来扩增3′同源臂，并引入酶切位点SacⅠ和MfeⅠ。
   
　　F3: 5′CAA GTC GAC GGA CTG TGT GCT TTG GTC AGC3′
   
　　R3: 5′CCA TGC TAA GGA CTC AGG AAG GAC ATA AAC3′
   
　　用来扩增锚定序列，并引入酶切位点SalⅠ和Bpu10Ⅰ。
   
　　F4: 5′GAT TAC TGG GCC CAT AAC TTC GTA TAG CAT AC3′
   
　　R4:5′CGA CCA CTC GAG CAT AAC TTC GTA TAA TGT ATG3′
   
　　用来扩增带有同向LoxP序列的锚定序列，并引入酶切位点PspOMⅠ和XhoⅠ。

　　1.3  3′同源臂的克隆

　　1.3.1  PCR扩增  以小鼠基因组为模板，利用引物F2和R2扩增3′同源臂。反应体系如下：小鼠基因组DNA模板1 μL（1 μg），10×长片段高保真PCR缓冲液2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.5 μL,20 mmol/L dNTP 8 μL,引物F2和R2各2 μL,高保真Taq酶1 μL,加水补足体系至25 μL。混匀后置PCR仪，94 ℃预变性1 min，然后采用两步法PCR按如下程序循环30次：94 ℃变性40 s→68 ℃延伸5 min。最后72 ℃延伸10 min。PCR产物于0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.3.2  连接T载体、鉴定及酶切  PCR产物连入T载体，反应体系为PCR产物2 μL, 反应缓冲液0.5 μL, T载体PCR2.1 0.5 μL。混匀后室温孵育5 min，冰浴2 min，加入感受态大肠杆菌DH5α，混匀后置冰上30 min，42 ℃热休克30 s，加入SOC培养液130 μL后于37 ℃复苏60 min。取菌液20 μL涂板，37 ℃培养箱培养过夜，采用蓝白斑及氨苄青霉素筛选。第2 d挑选单独的白色菌斑，摇菌并用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，利用内切酶SacⅠ和MfeⅠ鉴定，选择有4 kb阳性条带的质粒测序鉴定。完全正确后大量扩增并酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳分离条带，胶回收试剂盒纯化4 kb目的条带。

　　1.3.3  连接、转化及鉴定  SacⅠ和ApoⅠ酶切线性化质粒pBS，取线性化质粒50 ng与目的条带按末端浓度比1∶3混合，加入10×的T4DNA连接酶缓冲液2 μL，T4DNA连接酶0.1 μL，灭菌去离子水补足体系至20 μL。室温孵育5 min，冰上放置2 min，取转化感受态大肠杆菌10 μL，菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固定培养板上，37 ℃培养箱培养过夜。第2 d挑选单克隆、摇菌并用试剂盒小量抽提质粒，利用内切酶NheⅠ鉴定。

　　1.4  5′同源臂的克隆

　　1.4.1  以小鼠基因组为模板，利用引物F1和R1扩增5′同源臂。反应体系如下：小鼠基因组DNA模板0.5 μL（0.5 μg），10×长片段高保真PCR缓冲液2.5 μL，50 mmol/L MgCl2 2.5 μL,20 mmol/L dNTP 8 μL,引物F1和R1各1.5 μL,高保真Taq酶0.5 μL,加水补足体系至25 μL。混匀后置PCR仪，94 ℃预变性1 min，然后按如下程序循环30次：94 ℃变性40 s→58 ℃退火30 s→68 ℃延伸5 min。最后72 ℃延伸10 min。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.4.2  连接T载体、鉴定及酶切  PCR产物连入T载体，反应体系及转化过程同3′同源臂的克隆。利用内切酶MluⅠ和NheⅠ鉴定，选择有4 kb阳性条带的质粒测序鉴定。完全正确后大量扩增并酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳分离条带，胶回收试剂盒纯化4 kb目的条带。

　　1.4.3  连接、转化及鉴定  MluⅠ和NheⅠ酶切线性化质粒hZnf230pBS(3)，取线性化质粒50 ng，与目的条带按末端浓度比1∶3混合，连接反应体系及转化过程同3′同源臂的克隆。第2 d挑选单克隆、摇菌并抽提质粒，利用内切酶NheⅠ鉴定。

　　1.5  锚定序列克隆

　　1.5.1  PCR扩增  以小鼠基因组为模板，利用引物F3和R3扩增锚定序列。反应体系如下：小鼠基因组DNA模板0.5 μL（0.5 μg），10×长片段高保真PCR缓冲液2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.5 μL,20 mmol/L dNTP 6 μL,引物F3和R3各1.5 μL,高保真Taq酶0.5 μL,加水补足体系至25 μL。混匀后置PCR仪，94 ℃预变性1 min，然后采用两步法PCR按如下程序循环30次：94 ℃变性40 s→68 ℃延伸2 min，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物于0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.5.2  连接T载体、鉴定及酶切  PCR产物连入T载体，反应体系及转化过程同3′同源臂的克隆。利用内切酶SalⅠ和Bpu10Ⅰ鉴定，选择有1 kb阳性条带的质粒测序鉴定。完全正确后大量扩增并酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳分离条带，胶回收试剂盒纯化1 kb目的条带。

　　1.5.3  连接、转化及鉴定  SalⅠ和Bpu10Ⅰ酶切线性化质粒pDNR1，取线性化质粒50 ng，与目的条带按末端浓度比1∶3混合，连接反应体系及转化过程同3′同源臂的克隆。第2 d挑选单克隆、摇菌并用试剂盒小量抽提质粒，利用内切酶Bpu10Ⅰ鉴定（酶切产生片段0.5 kb，1.2 kb和3.2 kb）。正确的克隆用引物F4和R4扩增得到带有同向LoxP的锚定序列作为插入片段，PspOMⅠ和XhoⅠ酶切PCR产物，SalⅠ和 NotⅠ酶切线性化质粒hZnf230pBS(4)，按照前述方法连接、转化、扩增、抽提质粒，利用内切酶NheⅠ鉴定。

　　2  结果

　　2.1  PCR扩增  用特异性引物F1和R1、F2和R2、1和5:DNA分子量标记;2:3′同源臂;3,4和8:阴性对照;6和7:5′同源臂;9:锚定序列;10:DNA分子量标记.

　　图1  同源臂及锚定序列经PCR扩增后电泳（略）

　　Fig 1  Electrophoresis of the homologous arms and the targeting sequence amplified by PCR   

　　1,2和3:NheⅠ酶切鉴定hZnf230pBS(3);4和5:DNA分子量标记;6和7:NheⅠ酶切鉴定hZnf230pBS(5);8:NheⅠ酶切鉴定hZnf230pBS(4).

　　图2  限制性内切酶酶切鉴定小鼠Znf230基因打靶载体（略）

　　Fig 2  REase analysis of the mouse Znf230 gene targeting vector

　　F3和R3、F4和R4进行PCR扩增，均得到特异性PCR产物，所得PCR产物分别为4，4，1，1.1 kb，片段长度和预期一致（图1）。

　　2.2  3′同源臂克隆  采用定向克隆，用SacⅠ和MfeⅠ酶切含有插入片段的T载体，SacⅠ和ApoⅠ酶切质粒pBS，连接转化产物采用氨苄青霉素筛选，利用内切酶NheⅠ鉴定，正确连接产物酶切产生片段5.7 kb和2.7 kb；若无插入片段者质粒仅被线性化。正确的克隆命名为hZnf230pBS(3)（图2）。

　　2.3  5′同源臂克隆  采用定向克隆，用MluⅠ和NheⅠ酶切含有插入片段的T载体和质粒hZnf230pBS(3)，连接转化产物采用氨苄青霉素筛选，利用内切酶NheⅠ鉴定，正确连接产物酶切产生片段5.7 kb和6.7 kb；若无插入片段者酶切产生片段为5.7 kb和2.7 kb。正确的克隆命名为hZnf230pBS(4)（图2）。

　　2.4  锚定序列克隆  用PspOMⅠ和XhoⅠ酶切引物F4和R4扩增的PCR产物，SalⅠ和 NotⅠ酶切质粒hZnf230pBS(4)，连接转化产物采用氨苄青霉素筛选，利用内切酶NheⅠ鉴定，正确连接产物酶切产生片段6.7 kb和6.7 kb；若无插入片段者质粒被酶切产生片段5.7 kb和6.7 kb。正确的克隆命名为hZnf230pBS(5) （图2）。

　　2.5  克隆片段的DNA序列分析  条件基因打靶载体上的3′同源臂克隆、5′同源臂克隆和锚定序列克隆的测序工作是根据Genebank公布的基因序列设计引物，进行双向测序，测序工作由上海英骏生物技术有限公司完成。测序结果与Genebank公布的基因序列相比较，5′同源臂包括外显子Ⅱ，锚定序列包括外显子Ⅲ，外显子及其上下游300 bp范围内达到100%一致，其余区域达到99%一致。

　　3  讨论
   
　　Znf230是本室于2001年运用mRNA差异显示法从正常婚育男性的睾丸组织中新克隆的基因，位于11p15，共有2个转录本，其中1 kb的转录本在除外睾丸组织的成年人其他各脏器组织均无表达，在无精症患者的睾丸组织中也无表达[4]。在小鼠中有3个转录本，其中1 kb的转录本也只在小鼠的睾丸组织表达。研究发现，Znf230开始表达于小鼠出生后6 d的睾丸组织，14～21 d达到成年水平。该阶段是精子发生的重要时期，圆形精子开始出现在生精小管，据此推测其可能作为睾丸特异性转录因子在精子发生过程中发挥作用[5]。
   
　　本研究以pBS为载体,构建小鼠Znf230基因的条件打靶载体,经过PCR、酶切鉴定,以及序列分析证实打靶载体构建成功。在构建Znf230pBS时，运用高保真Taq 酶进行长链PCR 扩增，采用了热启动的方式，将循环次数控制在30次，对重组片段进行序列分析,同时采用定向克隆法以保证载体上插入同源臂的序列及方向的正确性，避免了通常构建基因打靶载体时筛选含有目的片段的阳性克隆的复杂与繁琐。在选择打靶位点时，笔者选择第三外显子作为锚定序列，在该外显子被敲除后由于移码突变作用导致终止密码提前出现，第三外显子后的其余3个外显子均无法表达，从而使该基因的重要功能域环指结构无法表达，基因功能丧失。本研究将同源臂及锚定序列以相反方向插入正筛选标志neo基因的两侧，避免了neo基因的强启动子启动下游外显子的表达，翻译出截短的蛋白发挥部分功能。
   
　　基因打靶效率的高低与打靶载体中同源臂的长度呈正相关,增加了同源臂的长度，使打靶载体Znf230pBS中同源臂总长度为8 kb (各4 kb),有利于提高重组效率。保留了高效切割的限制性内切酶Mlu I , 作为基因打靶时进行载体DNA 线性化位点，从而提高同源重组的效率[6]。本研究得到的条件基因替换型打靶载体Znf230pBS，为下一步建立无精症小鼠模型奠定基础。

　　：

　　[1]  Thomas K R,Capecchi M R. Sitedirected mutagenesis by gene tarueting in mouse embryonic stem cells through homologous recombination with isogenic DNA constructs[J]. Cell, 1987,51(3):503512.

　　[2]  Gu H,Marth J D,Orban P C,et al. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell typespecific gene targeting[J]. Science, 1994,265(5168):103106.

　　[3]  杨  晓,黄培堂,黄翠芬. 在小鼠进行基因打靶的研究进展[J]. 通报, 2000,45(15):1584.

　　[4]  Zhang S Z,Qiu W M,Wu H,et al. The shorter zinc finger protein ZNF230 gene message is transcribed in fertile male testes and may be related to human spermatogenesis[J]. Biochem, 2001,359(PT3):721727.

　　[5]  Qiu W,Zhang S,Xiao C,et al. Molecular cloning and characterization of a mouse spermatogenesisrelated ring finger gene znf230[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2003,306(2),34753.

　　[6]  M..u ller U. Ten years of gene targeting: targeted mouse mutants, from vector to phenotype analysis[J]. Mech Dev, 1999,82(12):321.