舟山眼镜蛇毒L?氨基酸氧化酶的分离纯化、理化及酶学性质
作者：林丽珊, 张志强, 陈洲, 许云禄
【摘要】 目的从舟山眼镜蛇蛇毒中分离L?氨基酸氧化酶(LAO),测定其理化和酶学性质。方法应用Sephadex G?100凝胶色谱和POROS CM20离子交换色谱分离纯化LAO;Wellner和Lichtenberg法测定LAO活力;SDS?PAGE法测定相对分子质量。结果舟山眼镜蛇蛇毒经Sephadex G?100凝胶色谱和两次POROS 20 离子交换色谱后,获得LAO纯品(暂定名NA?LAO)。NA?LAO在非还原和还原条件下相对分子质量均为58 kD左右;其反应最适pH为8.0,最适温度为60 ℃,对L?苯丙氨酸的米氏常数(Km)为3.08 mmoL/L。结论应用凝胶过滤色谱和离子交换色谱可从舟山眼镜蛇毒中分离纯化LAO。
【关键词】 眼镜蛇毒液类; 氨基酸氧化还原酶
蛇毒成分复杂,主要为酶和毒素,L?氨基酸氧化酶(EC.1.4.3.2)在蛇毒中分布非常广泛,在蝰科、响尾蛇科、眼镜蛇科以及蝮蛇科中都有分布[1?4]。L?氨基酸氧化酶(L?amino acid oxidase,LAO)是蛇毒中一种重要的活性组分,能够催化L?氨基酸的氧化脱氨反应,生成相应的α?酮酸、氨以及过氧化氢[5],具有多种生物活性,如诱导血管内皮细胞凋亡、抑制或诱导血小板聚集、细胞毒性和抗菌活性等[6?10]。已从几种蛇毒中分离得到LAO,笔者应用凝胶色谱和离子交换色谱从舟山眼镜蛇蛇毒分离LAO,并对其部分理化和酶学性质进行初步研究。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1蛇毒舟山眼镜蛇(Naja atra)蛇毒冻干粉,福建医科大学蛇毒研究所提供。
1.1.2试剂与仪器L?苯丙氨酸(批号040924,上海翔军生物科技有限公司);砷酸钠（Lot#:0892B82,美国Amresco公司）;过氧化氢酶（AA104?1,美国Sigma公司）。Sephadex?G100凝胶柱(瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司);CM20阳离子交换填料预装柱(POROS 20,美国Applied Biosystems公司);BioCAD纯化工作站(美国Applied Biosystems公司);自动部分收集器(BSZ?100)和恒流泵(HL?1,上海沪西分析仪器厂);恒温摇床(美国Forma公司);紫外分光光度计(美国Bio?rad公司);试剂均为进口或国产分析纯。
1.2方法
1.2.1眼镜蛇蛇毒的凝胶色谱Sephadex G?100凝胶柱(2.6 cm×100 cm)用HAc?NaAc缓冲液(pH 5.8,0.05 mol/L+NaCl 0.05 mol/L)预先平衡过夜。称取眼镜蛇粗毒0.5 g溶于10 mL双蒸水,4 ℃静置过夜,4 ℃ 10 000 r/min离心10 min。取上清液凝胶柱,用HAc?NaAc缓冲液洗脱,流速16 mL/h。收集洗脱液,4 mL/管,根据D(280 nm)值绘出洗脱曲线。
1.2.2凝胶色谱组分LAO活力按[5]介绍的流程和反应体系进行分离组分酶活力测定。凝胶色谱洗脱组分0.1 mL与L?苯丙氨酸反应,以终产物的光密度值[D(300 nm)]为指标，以反应体系中加HAc?NaAc缓冲液0.1 mL取代蛇毒组分为未加酶对照。一个活力单位定义为在上述条件下得到0.03D300 nm所需的酶量。
1.2.3LAO纯化合并经凝胶色谱收集的具有LAO活性的组分。以POROS 20进行纯化。线性梯度洗脱(A液:0.05 mol/L,pH 5.8的HAc?NaAc缓冲液;B液:含有0.5 mol/L NaCl的平衡液),收集洗脱蛋白峰,浓缩和脱盐。测定POROS 20离子交换层析各组分的LAO活性,收集具有活性的组分,用POROS 20离子交换层析,以0.02 mol/L,pH 6.2的HAc?NaAc缓冲液平衡,线性梯度洗脱(A液:0.02 mol/L,pH 6.2的HAc?NaAc缓冲液;B液:含有0.5 mol/L NaCl的平衡液),进一步纯化,收集活力峰,浓缩、透析脱盐。
1.2.4LAO纯度鉴定及相对分子质量按碱性不连续系统进行。样品按是否含有2%β?巯基乙醇分为还原性和非还原性两种。在Hoefer电泳仪上电泳2 h,稳流12 mA/10 cm×10 cm。常规染色脱色。在Image Master VDS凝胶成像系统上依据标准蛋白绘制标定曲线,相对分子质量。
1.2.5蛋白质浓度采用文献[11]方法,将待测蛋白质溶液适当稀释,在波长260 nm和280 nm处分别测出D值,然后利用280 nm和260 nm波长下的吸收差求出蛋白质的浓度。
蛋白质浓度(mg/mL)=1.45D(280 nm)-0.74D(260 nm)
1.2.6LAO对温度和pH适应性最适pH测定:在pH 6.0~10.0缓冲液中,其他条件不变,测定酶活力。最适温度测定:酶液在0.4 moL/L,pH 7.8的Tris?HCl缓冲液中,测定20,30,40,50,60和70 ℃下的酶活力。以酶活力最高者为100%,其余折算为最高活力的百分数,并以pH或温度为横坐标,最高活力百分数为纵坐标,绘制酶活力适应曲线。
1.2.7LAO米氏常数(Km)酶液与不同浓度L?苯丙氨酸反应,利用反应终止法测定酶反应初速度(V),根据Lineweaver?Burk作图法求出该酶对L?苯丙氨酸的Km值[12]。
2结果
2.1眼镜蛇蛇毒凝胶色谱眼镜蛇毒粗毒经Sephadex G?100凝胶层析后获得5个蛋白峰,分别标记为Ⅰ~Ⅴ。其中第Ⅱ峰具有LAO活力。从粗毒500 mg中可获得Ⅱ组分38.6 mg,蛋白回收率约7.8%(图1,表1)。
样品:眼镜蛇蛇毒(500 mg);凝胶柱:Sephadex G?100 2.6 cm×100 cm;洗脱液:HAc?NaAc缓冲液(0.05 mol/L,pH 5.8,含0.05 mol/L NaCl);流速:16 mL/h,4管/h;阴影部分为L?氨基酸氧化酶活性组分.
图1眼镜蛇蛇毒的Sephadex G?100凝胶色谱
Fig 1Gel filtration of Naja atra venom on Sephadex G?100
2.2LAO纯化凝胶色谱第Ⅱ峰经CM20预装柱POROS 20 进行分离,分离后可得到7个洗脱峰,其中第4峰具有LAO活力(图2)。合并收集该组分，再次用POROS 20 纯化,得到A、B两个蛋白峰,经活性测定,其中第B峰具有LAO活性。该组分经SDS?PAGE鉴定为电泳纯暂定名为NA?LAO。从粗毒到获得NA?LAO各层析步骤的目的组分得率及酶活性变化(表1),NA?LAO在眼镜蛇毒粗毒中的含量约为0.3％。 表1L?氨基酸氧化酶的酶活力变化及得率样品:第Ⅱ组分;上样体积:5 mL;色谱柱:CM20 (POROS 201.6 mm×100 mm);缓冲液体系:A液:HAc?NaAc(pH 5.6,0.05 mol/L);B液:A液+0.5 moL/L NaCl;梯度:30%~100%,25CV;流速1 mL/min;出现“—”组分具有L?氨基酸氧化酶活性.
图2POROS 20 离子交换色谱图
Fig 2Ion?exchange chromatography of LAO on CM20 (POROS 20)
2.3NA?LAO纯度鉴定及相对分子质量NA?LAO经12.5%SDS?PAGE电泳为一条清晰的蛋白带(图3),NA?LAO不论是还原还是非还原SDS?PAGE电泳均为一条带,说明NA?LAO为单链蛋白,相对分子质量约58 kD。
2.4NA?LAO对温度和pH的适应性在LAO酶活力测定的体系中,改变反应温度,其余条件不变,NA?LAO在20~70 ℃区间,60 ℃时活力最高。以60 ℃时LAO活力为100%,绘制NA?LAO在不同温度下的酶活力(图4)。
在pH 6.0~10.0的缓冲体系,NA?LAO活性在pH 8.0时为最高,在pH 9.0~10活性较pH 8.0为低,但仍保持较高活性。以pH 8.0时酶活力为100%,绘制NA?LAO在不同pH下的酶活力(图5)。
2.5LAO米氏常数(Km)以苯丙氨酸为底物,在pH 7.8,37 ℃下,根据Lineweaver?Burk双倒数作图法作图,得出的方程为:[1/V]=0.0276+0.0851*[1/S],眼镜蛇LAO对L?苯丙氨酸的Km值为3.08 mmoL/L(图6)。
3讨论
3.1眼镜蛇毒LAO的分离纯化蛇毒是多种酶或非酶蛋白质或多肽的混合物,含有多种相对分子质量大小不等、等电点各异的蛋白质或多肽分子。分离蛇毒中活性成分有凝胶过滤层析法、离子交换层析法、疏水层析法和反相层析法等。笔者根据眼镜蛇毒中各种组分相对分子质量的差异应用Sephadex G?100凝胶过滤法进行分离,具有LAO活性的组分为相对分子质量相对较大的成分,约占粗毒7.8％,这一过程去除了大量相对分子质量低的组分(约90%),为进一步用离子交换层析降低了层析柱负荷。由于凝胶色谱分级所得到的活性组分间还含有不少其他非LAO的蛋白质,因此,根据蛋白质的荷电性质差异,应用ROROS 20弱阳离子交换色谱进一步分离,发现70％为非LAO蛋白质。根据相关和前期预实验的结果,笔者采用在不同pH条件下的ROROS 弱阳离子交换色谱,将相对分子质量和等电点接近的蛋白质进一步分离,结果发现经第一次ROROS 色谱所得具有LAO活性的蛋白峰再次经ROROS 色谱柱(洗脱液pH由5.6改为6.2,洗脱梯度由30%~100％改为0~50％)获得两个色谱峰,含有LAO的为第B峰。
3.2蛇毒LAO的理化性质及活性根据以往的研究报道,从不同蛇毒中分离纯化出来的LAO有不同的结构,以同二聚体或异二聚体形式存在的相对分子质量分布在100~142 kD,以单体蛋白质形式存在的相对分子质量55~60 kD[3]。本文分离得到的眼镜蛇毒LAO即NA?LAO在还原与非还原条件下,SDS?PAGE电泳均显示一条带,说明它为单链蛋白质,相对分子质量为58 kD,与文献报道的江浙蝮蛇毒LAO相似。Tan等报道的同属眼镜蛇科的孟加拉眼镜蛇(Naja kaouthia)毒LAO及Ahn等报道的眼镜王蛇毒LAO均为同二聚体蛋白,相对分子质量分别为112和135 kD[1,4],说明不同蛇毒的LAO的理化性质差异很大,但是LAO单体或二聚体存在与蛇种关系不大。
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