人精子甘露糖受体对地鼠卵母细胞超微结构的影响

               作者：江澍, 林典梁, 陈文列, 江一平　

【摘要】  目的研究人精子甘露糖受体(MR)在精卵融合中的作用。方法去透明带金黄地鼠卵经不同浓度的纯化人精子MR作用后,用透射显微镜观察卵母细胞超微结构的变化。结果MR作用卵母细胞后,卵母细胞内的皮质颗粒(CG)减少,并伴随有CG胞吐现象,同时卵母细胞表面的微绒毛数量减少。结论MR作用于卵母细胞表面后,可触发CG胞吐,并促使卵母细胞表面微绒毛减少,提示MR在介导精子与卵母细胞识别与融合中起作用。

【关键词】  甘露糖; 精子; 精子卵子相互作用; 膜融合; 卵母细胞

    上世纪90年代有研究发现,人精子头部存在甘露糖的互补分子,并且证明该类分子与受精过程直接相关。由于该类分子均具有甘露糖受体样作用,因此称之为甘露糖受体(mannose receptor,MR)。笔者和Gabriele等的前期研究提示,人精子MR可能在精卵的膜识别与融合时起介导作用[1?3]。笔者通过亲和层析法提纯的MR取代精子,直接作用于去透明带的金黄地鼠卵母细胞,用透射电子显微镜观察卵母细胞的变化,了解MR在精卵膜融合中的作用。

    1材料与方法

    1.1材料

    1.1.1精液标本采集手淫法采集健康有正常生育能力供精者精液,常规分析各项指标符合WHO精液标准[4]。

    1.1.2动物6~8周龄叙利亚金黄地鼠(Mesocricetus auratus,福建医科大学实验动物中心提供；合格证号:闽实动条准第01?07号)，纯系鼠料饲养,每日补充新鲜胡萝卜、鸡蛋、牛奶和维生素E;动物饲养室以光和人工光照相结合,光暗时间比为12 h/12 h。选择8~12周龄鼠用于超排卵实验。

    1.1.3主要试剂BWW培养液[5],透明质酸酶(美国Sigma公司),胰酶(美国Difco公司)。

    1.1.4主要仪器透射电子显微镜(Hu?12A,日本Hitachi公司)。

    1.2方法

    1.2.1MR分离提纯亲和层析法从人精子蛋白萃取液中纯化人精子MR[6?7]。

    1.2.2凹玻板硅化甲基硅油用氯仿溶成5%溶液,移入经超净处理并干燥后的凹玻板内静置1 min;回收硅油,控干凹玻板,180 ℃恒温箱中烤1 h;三蒸水冲去浮油,烤干。

    1.2.3去透明带地鼠卵获取选取动情周期第1 d(按压腹部见阴道口含乳白色分泌物)雌性金黄地鼠,于上午9~10时注射孕马血清促性腺激素(PMSG,天津市华孚高新生物技术公司)50 IU;55~58 h后注射人绒毛膜促性腺激素(HCG,上海生物化学制药厂)50 IU;16~18 h后将地鼠用乙醚麻醉后,断头解剖;剪下双侧输卵管放入预冷(4 ℃)的BWW中准备取卵。将超排卵地鼠输卵管移入凹玻皿中,在体视显微镜下用解剖针刺破输卵管的壶腹部,挤出卵丘团并用BWW洗净;用BWW溶解的0.1%透明质酸酶消散卵丘颗粒细胞,用BWW洗涤多遍,洗净卵子;用预冷(4 ℃)BWW溶解的0.05%胰酶消化透明带。体视显微镜监控消化结果,待透明带变薄而松弛、欲失未失时立即将卵移至4 ℃预冷的BWW中洗涤3遍,去除残留的胰酶,获得裸卵母细胞。

    1.2.4卵母细胞分组将获得的去透明带金黄地鼠卵母细胞分成4组(各15个):对照组,加入等量溶剂对照液; MR低、中、高浓度组,MR终浓度分别为0.95,1.43,2.86 μg/mL。各组置37 ℃孵育3 h。将卵母细胞移入凹玻板中,用37 ℃预热的1%BSA/PBS洗细胞1次,3%戊二醛?1.5%多聚甲醛(福建医科大学电镜室提供)固定40 min。

    1.2.5电镜标本制备与观察用1%BSA/PBS洗细胞1次,将卵母细胞移入预先硅化的干燥凹玻板中(带出的液体量约2 μL),吸少量(5~7 μL)预先经过补体灭活处理(56 ℃水浴30 min)的鸡蛋清将卵母细胞包埋起来,在液滴周边表面轻轻加入3%戊二醛/1.5%多聚甲醛300 μL,此时蛋清与卵母细胞一起凝成卵胶块。用镊子小心将其夹入含3%戊二醛?1.5%多聚甲醛400 μL的Eppendorf管中,封口膜封好,4 ℃固定过夜。体视解剖镜下将卵胶块尽量修小一些,按常规1%OsO4后固定,梯度丙酮脱水,Epon618包埋,半薄切片定位;超薄切片用醋酸铀和枸橼酸铅复染。透射电子显微镜观察,比较各组卵母细胞超微结构特点。

    2结果

    对照组细胞形态完整,细胞内的细胞器轮廓清晰,胞膜下的皮质颗粒(CG)较多,细胞表面的微绒毛较长而且数量较多;MR各浓度组卵母细胞质膜下的CG比对照组相对减少,卵母细胞表面的微绒毛比对照组短而少,并伴有剂量依赖性,即随着MR浓度的增加,微绒毛数呈减少趋势(图1)。MR各浓度组可见CG向卵质膜靠拢并发生膜融合(图2A);卵膜表面常见有CG胞吐后留下的“凹坑”,内含未吐尽的CG内含物(图2B)。

    3讨论

    卵子在与第一个精子发生质膜融合后,就会发生一系列的变化,尤其是卵的激活。卵的激活主要表现在细胞内钙浓度的上升、CG的胞吐、细胞周期的恢复和母系mRNA的补充等[8]。但是具体是何物质引起了这些变化,其作用机制如何,目前尚未阐明。笔者前期研究发现,人精子在顶体反应后MR主要集中在精子头部赤道段和顶体后区质膜上,而该区域正是精子首先与卵母细胞膜最早接触并融合的部位,因而首次提出MR可能在精卵的膜识别与融合中起介导作用[1,3]。随后,Gabriele等的研究也得出了与之相似的判断[2]。

    卵母细胞在受精时的最主要超微结构特征变化,就是CG的胞吐及其内容物的释放,以及卵母细胞表面微绒毛的减少。受精导致卵母细胞CG胞吐的事实表明,CG胞吐是一种受体分子介导的受调分泌。CG胞吐后,其内容物将促使发生透明带反应、卵周隙中CG膜的形成等变化,从而阻止剩余精子穿透卵外被、保证单精入卵[8?11]。本实验是将纯化的人精子MR取代精子,直接作用于去透明带金黄地鼠卵母细胞,用透射电镜观察卵母细胞的超微结构,其结果与受精时卵母细胞的变化相符,更进一步直接表明了MR在介导精卵的膜识别与融合中发挥着重要作用，同时也提示，在卵母细胞质膜表面存在着MR的互补分子。有实验表明,卵母细胞上的精子结合位点可能在表面的微绒毛上,受精后卵质膜表面的微绒毛数量减少可能是MR互补分子减少的一种直观表现[12?14]。

【】
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