吸入一氧化氮对大鼠无心跳供体肺缺血再灌注损伤的影响

【摘要】  目的 探讨一氧化氮(NO)对大鼠无心跳供体(NHBD)肺缺血再灌注损伤(IRI)的影响。 方法 大鼠随机分为Ⅰ组:有心跳供体(HBD)组;Ⅱ组:NHBD-吸氧组;Ⅲ组:NHBD-吸氧＋NO组。Ⅰ组在处死的同时灌注4 ℃低钾右旋糖苷液(LPD),Ⅱ组、Ⅲ组处死后维持辅助呼吸,放置室温中30 min再灌注LPD液。供肺置于4 ℃ LPD 液中4 h 后行原位左肺移植术。术后维持辅助呼吸1 h。Ⅲ组通气吸氧的同时吸入浓度为40×10-6的NO。 结果 与Ⅱ组比较,Ⅲ组肺顺应性、动脉血氧分压高,肺组织丙二醛含量低(P<0.05)。 结论 吸入低浓度NO可减轻大鼠NHBD肺缺血再灌注损伤。

【关键词】  一氧化氮; 组织供者; 肺移植; 缺血; 再灌注损伤; 疾病模型,动物

    ABSTRACT:  Objective  To evaluate the effect of inhaled nitric oxide(NO) on the ischemia-reperfusion injury(IRI) in rat lungs from non-heart-beating donors(NHBD).  Methods  Sixty Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups: groupⅠ, heart-beating donor; groupⅡ, NHBD with 30 minutes of warm ischemia time(WIT) and oxygen inhaled; group Ⅲ, NHBD with 30 minutes of WIT and oxygen and NO inhaled.  The donor lungs of groupⅠ were flushed with low potassium dextran(LPD) solution at 4 ℃ after asystolia while the lungs of groupⅡ and group Ⅲ remained ventilated at the room temperature for 30 minutes after asystolia and then were flushed with LPD solution.  All of the donor lungs remained inflated when they were stored in LPD solution at 4 ℃ for 4 hours.  The recipient rats underwent orthotopic left lung transplantation.  After transplantation 1 hour’s reperfusion and ventilation was manipulated.  The donor lungs of group Ⅲ inhaled additional NO with the concentration of 40×10-6 at the time of ventilation.  Results  Compared with the group Ⅱ, the pulmonary compliance and the oxygen partial pressure of the arterial blood are higher, the MDA in the lung lower(P<0.05).  Conclusion  The low-dosage of NO is an effective treatment to attenuate the acute injury resulted from the ischemia-reperfusion in the rat lungs from non-heart-beating donors.

    KEY WORDS:  nitric oxide; tissue donors lung transplantation; ischemia; reperfusion injury; disease models,animal

    肺移植是晚期肺部疾病的成熟方法。但肺移植例数却一直得不到显著提高,其中一个重要原因就是合适供体肺严重短缺。若能应用无心跳供体(NHBD)肺,将极大缓解供肺来源紧张的状况。先前笔者的研究已证实NHBD肺可作为供体肺［1］。但缺血再灌注损伤(IRI)限制了NHBD肺应用。为减少IRI对NHBD肺造成的影响,保护NHBD肺的结构和功能的完善,笔者探讨一氧化氮(NO)对NHBD肺的保护作用。

　　1  材料和方法

　　1.1  动物 

　　健康雄性Sprague-Dawley大鼠60只,体质量(350±12.5)g(上海第二医科大学实验动物部,合格证书:医动字第07-23-4号)。

　　1.2  主要仪器 

　　动物人工呼吸机(DH-140B型,浙江医科大学医疗仪器实验厂);低钾右旋糖苷液(LPD,福州嘉华制药有限公司);NO监测仪(英国Micro Medical 公司);NO 标准气体(北京普莱克斯气体有限公司);手术显微镜(SXP-1B型,上海医用光学仪器厂);血气分析仪(i-STAT便携式,美国雅培公司);

　　1.3  方法

　　1.3.1  分组 

　　大鼠随机分为3组，供、受体各10只。Ⅰ组:有心跳供体(HBD)组;Ⅱ组:无心跳供体(NHBD)-吸氧组;Ⅲ组:NHBD-吸氧＋NO组。Ⅰ组在处死的同时灌注4 ℃ LPD;Ⅱ组、Ⅲ组处死后维持辅助呼吸,放置室温中30 min再灌注LPD液。供肺置于4 ℃ LPD 液中4 h 后行原位左肺移植术。术后维持辅助呼吸1 h 。Ⅲ组通气吸氧的同时吸入浓度为40×10-6 的NO。

　　1.3.2  取HBD肺 

　　供体大鼠腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg。仰卧位,气管插入16号穿刺针,连接动物人工呼吸机,吸入氧浓度(FiO2)50%,呼吸模式为持续容量控制,呼吸频率80~90 min-1,潮气量1 mL /100 g,保持呼气末正压(PEEP)2~3 cmH2O(1 cmH2O=9.8 Pa)。自左股静脉注射肝素钠500 IU。5 min后剪开胸骨及腹壁,剪断腹主动脉放血。心脏停跳的同时于肺动脉主干插入20号穿刺针,结扎并固定,剪破左心耳,维持通气的同时自穿刺针灌注4 ℃ LPD液20 mL,灌注压25 cmH2O,在肺吸气末切下心肺组织,立即浸泡在4 ℃ LPD液中5 min,剪下膨胀的左肺,保存在4 ℃ LPD液中4 h。

　　1.3.3  取NHBD肺 

　　处死供体鼠后,室温下维持通气30 min再灌注LPD液。NHBD-吸氧组吸入气不含NO,NHBD-吸氧＋NO组吸入浓度为40 ×10-6的NO。

　　1.3.4  左肺移植 

　　受体鼠麻醉、插管后,右侧卧位,经左第5肋间切口充分暴露左肺门,尽可能靠近远心端剪除左肺。供肺包以冰水浸泡的湿纱布,放入左侧胸腔,在手术显微镜下9-0锦纶线依次吻合左肺静脉、左主支气管、左肺动脉,连续吻合主支气管膜部,软骨部间断吻合,10-0锦纶线间断吻合肺动脉,连续吻合肺静脉。左肺获得再灌注后,间断加大PEEP,使其充分膨胀。Ⅲ组受体在肺移植过程中维持NO通气(浓度为40×10－6)。

　　1.4  观察指标

　　左肺再灌注后1 h,经右第5肋间结扎右肺门,采集数据。

　　1.4.1  肺顺应性

　　呼吸机直接读取数据肺顺应性=潮气量/(吸气末压-呼气末压)

　　1.4.2  动脉血气 

　　受体鼠结扎右肺门前后15,30 min分别从颈动脉放血0.3 mL,测定动脉血氧分压(PaO2)和二氧化碳分压(PaCO2)。

　　1.4.3  肺组织丙二醛(MDA)含量 

　　取1 cm×1 cm的肺组织,冲洗干净,研磨成匀浆,按［2］硫代巴比妥法测MDA含量。

　　1.4.4  肺组织光镜 

　　LPD液灌注前取1 cm×1 cm右肺组织,结扎右肺门后0.5 h取1 cm×1 cm左肺组织行光镜组织学检查(H-E染色×40)。

　　1.5  统计学处理 

　　数据以x±s表示,采用SPSS 10.0统计软件处理,组间比较采用One-way ANOVA方差分析。P<0.05为差别有统计学意义。

　　2  结  果

　　2.1  肺组织顺应性、MDA含量及动脉血氧分压  Ⅰ组与Ⅱ组比较差别无统计学意义;Ⅲ组与Ⅱ组比较差别有统计学意义(表1,2)。表1  3组实验大鼠肺顺应性和肺组织MDA含量比较（略）表2  3组实验大鼠动脉血气分析比较（略）

　　2.2  肺组织光镜检查 

　　Ⅰ组和Ⅱ组肺泡间质均有一定量炎性细胞浸润(P<0.05),Ⅲ组炎性细胞浸润相对较轻(图1)。

　　3  讨  论

    当前,适宜肺供体的严重短缺极大制约了肺移植的开展。Egan等首次应用无心跳供体肺于肺移植研究中,发现狗肺死后尸体原位热缺血1 h、取出冷保存4 h、移植1 h后仍可维持完善的气体交换和血流动力学功能［3］。本课题组早期研究显示,与HBD移植肺相比,大鼠NHBD肺热缺血30 min,移植后肺的顺应性、肺能量代谢物含量,肺气体交换功能维持正常［1］。本次研究显示,Ⅱ组和Ⅰ组移植肺顺应性、血气分析和肺组织MDA含量差别无统计学意义。

    但是,供肺在保存过程中存在的IRI,不仅造成肺移植患者术后的早期死亡,而且增加了急性排斥反应的发生率,导致长期存活受体的移植物失功［4］。NHBD肺还存在热缺血过程,随着热缺血时间的延长,术后IRI更加严重［1,5］。移植肺发生IRI的过程中,内源性NO明显减少［6-7］。内源性NO可对肺 IRI产生明显的保护效果。研究人员运用多种方法处理实验对象,包括腹腔注射曲匹地尔、鼻饲氯匹格雷、肺保护液内加入硝酸甘油(NTG)、左旋精氨酸等,以促进机体内源性NO的产生,减轻IRI,使肺功能显著改善［8-12］。但所有这些实验都是在有心跳供体的肺移植中所取得的成果。

    为了获取结构和功能保存更好的NHBD肺,本研究在前期工作的基础上,给予采用外源性低浓度NO(40×10－6)于大鼠NHBD肺移植中,并贯穿于供肺保存、手术期间及术后1 h整个过程。结果发现,吸入NO组(Ⅲ组)和单纯吸氧组(Ⅱ组)相比,吸气末压分别为(19.09±0.35)cmH2O和(21.37±0.61)cmH2O,肺组织顺应性分别为(0.179±0.0020)和(0.158±0.0058),两者比较有统计学意义,提示肺的IRI得到明显改善。结扎右肺门后15,30 min的PaO2也得到很大的提升,说明移植肺氧合功能也有一定程度的提高;同时肺组织MDA含量显著降低。MDA 是氧自由基介导的细胞膜脂质过氧化产物, 是氧自由基致机体组织细胞损伤的重要指标,是器官IRI最主要的因素,检测MDA是判断是否发生脂质过氧化反应的重要方法［2］。Ⅲ组MDA降低,提示IRI造成氧自由基对细胞的损害明显缓解。这和肺组织病理切片上所观察到的结果是一致的。本研究结果与文献报道基本一致［13-15］。

    笔者认为,吸入低浓度外源性NO对NHBD肺的IRI具有一定的缓解作用。

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