鲎抗脂多糖因子对晚期炎症因子高迁移率族蛋白?1体外效应的拮抗作用

           作者：吴林青, 许伟群, 张秋玉, 胡海霞, 祝先进, 苏东辉 

【摘要】  目的 观察鲎抗脂多糖因子(LALF)对小鼠巨噬细胞晚期炎症因子高迁移率族蛋白?1(HMGB1)功能的拮抗效应,探讨LALF对晚期内毒素血症动物的保护机制。 方法 用HMGB1刺激小鼠腹腔巨噬细胞,加入或不加LALF,迁移实验检测巨噬细胞趋化作用,ELISA检测培养上清液中肿瘤坏死因子(TNF)?α浓度。 结果 巨噬细胞迁移指数的增加呈HMGB1剂量依赖性,HMGB1刺激后巨噬细胞培养上清液TNF?α浓度显著增高。LALF与HMGB1预混合显著降低巨噬细胞的迁移指数和培养上清液TNF?α浓度。 结论 LALF可能通过抑制HMGB1而发挥其对晚期脓毒症动物的保护作用。

【关键词】  高迁移率族蛋白; 脓毒症; 鲎抗脂多糖因子； 趋化作用

　　ABSTRACT:  Objective  To investigate the effects of limulus anti?lipopolysaccharide factor(LALF) on the late proinflammatory cytokine of high mobility group box 1(HMGB1).  Methods  The primary mouse macrophages were cultured and stimulated by HMGB1.  Macrophage migration was determined by the use of chemotaxis chamber.  ELISA quantitated the culture supernatants for TNF?α production.  LALF was added to explore the effects of HMGBI and TNF?α production in culture.  Results  The chemotactic index of macrophages and the concentration of TNF?α in the culture supernatants evidently increased in dose?dependent manner in HMGB1 groups and prominently decreased by the LALF co?incubated.  Conclusion  HMGB1 was firstly indicated in this study to be directly inhibited by LALF in late course of endotoxemia.
   
　　KEY WORDS:  high mobility group proteins; sepsis; macrophage; horseshoe crabs; lipopolysaccharides; tumor necrosis factor?alpha; inflammation

　　脓毒症是重症监护病房病人常见的死因。肿瘤坏死因子(TNF)?α、白细胞介素(IL)?1等促炎症因子曾被普遍认为是引起脓毒症死亡的“核心因子”[1],以往认为在这些促炎症因子达峰以后再给予抗内毒素的难以逆转脓毒症的病程。具有重要意义的是,Levin实验室给致死量细菌内毒素即脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)攻击后4，10 h甚至24 h的Swiss小鼠注射天然鲎抗脂多糖因子(limulus anti?lipopolysaccharide factor,LALF)，实现了对动物晚期脓毒症的有效保护[2],提示LALF可能对促炎症因子消退后的某个或某些晚期介质起拮抗作用。1999年,Wang等发现高迁移率族蛋白?1(high?mobility group box 1,HMGB1或HMG?1)是脓毒症致死性全身反应的一种重要的晚期促炎性因子[3]。本研究以体外培养的小鼠巨噬细胞为实验对象,观察LALF对HMGB1部分生物学活性的影响,探讨LALF对脓毒症晚期的实验动物发挥保护作用的机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  动物  昆明种小鼠,雄性,体质量20～25 g[福建医科大学实验动物中心,许可证号scxk(闽)2005?0003]。饲以标准饲料,随意饮水。

　　1.1.2  主要试剂  RPMI?1640培养基、PBS平衡盐溶液(美国Hyclone公司)。E.coli O55:B5 LPS、重组HMG?1(美国Sigma公司)。48孔微迁移板(AP48,美国Neuro Probe公司)。TNF?α ELISA试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)。LALF（美国麻萨诸塞州Woodhole海洋生物实验室Wainright博士惠赠）。大鼠抗小鼠TLR2(IgG)?FITC及正常大鼠IgG?FITC(美国Santa Cruz公司)。

　　1.2  方法

　　1.2.1  小鼠腹腔巨噬细胞制备  颈椎脱臼处死小鼠,以PBS腹腔灌洗法收集腹腔巨噬细胞悬液,1 500 r/min(4 ℃)离心10 min,弃上清,洗涤1次,用含10％胎牛血清的1640培养液调整细胞浓度为1×106 mL-1,根据需要接种于24孔(1 mL/孔)或6孔(2 mL/孔)细胞培养板中,置37 ℃ CO2培养箱培养4 h后去除未贴壁细胞换液继续培养备用。

　　1.2.2  趋化实验  参照[4?5]方法。将含不同浓度HMGB1的无血清培养液25 μL加入下室,同时以细胞稀释液作为阴性对照。另一组在趋化板下室的细胞中加入不同浓度LALF与HMGB1预混合培养液,同时设单独培养液、单独LALF和单独HMGB1对照组。再将1片5 μm孔径的聚碳酸酯膜覆盖在小室上,最后将巨噬细胞(1×106 mL-1)50 μL加入到上室中,置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育90 min。孵育后聚碳酸酯膜用甲醇固定并进行考马斯亮蓝染色。在光学显微镜下用高倍镜计数5个视野下的迁移细胞数,结果用迁移指数表示:
   
　　迁移指数＝试验组迁移的细胞数/对照组迁移的细胞数

　　一式3份,重复3次实验。

　　1.2.3  ELISA 检测培养上清液的TNF?α浓度  小鼠腹腔巨噬细胞接种于24孔细胞培养板,在不同时间加入含1 μg/mL HMGB1的培养液,设单独培养液的对照组。另一组细胞加入不同浓度LALF与HMGB1 1 μg/mL预混合培养液,继续培养8 h,设单独培养液、单独LALF、单独HMGB1的对照组。吸取培养上清,用双抗体夹心ELISA法检测TNF?α含量,操作方法按说明书进行。一式3份,重复3次。

　　1.3  统计学处理  测定结果数据以x±s表示,采用SPSS 10.0统计软件进行分析,组间差异以单因素方差分析进行检验,P<0.05为差别具有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  LALF对HMGB1诱导巨噬细胞趋化作用的影响

　　2.1.1  HMGB1对巨噬细胞趋化作用的诱导  HMGB1显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的迁移指数,其峰值所对应的HMGB1浓度为1 μg/mL。在0.1～1 μg/mL浓度区间,HMGB1的效应呈剂量依赖性(图1)。

　　HMGB1:晚期炎症因子高迁移率族蛋白?1.  与HMGB1 0 μg/mL对照组比较,☆:P<0.01.

　　图1  不同浓度HMGB1对巨噬细胞迁移的作用（略）

　　Fig 1  Effect of HMGB1 on macrophage migration

　　2.1.2  LALF对HMGB1诱导趋化作用的影响  不同浓度LALF(5,10,15 μg/mL)与1 μg/mL HMGB1预混合巨噬细胞迁移试验显示,LALF显著降低巨噬细胞的迁移指数,这种抑制效应呈LALF剂量依赖性。单独LALF对巨噬细胞的迁移指数无影响(图2)。

　　2.2  LALF对HMGB1诱导巨噬细胞分泌TNF?α的影响

　　2.2.1  HMGB1对巨噬细胞分泌TNF?α的诱导  对照组单独使用培养液刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF?α(35±5)pg/mL。加入1 μg/mL HMGB1 4, 8,24 h测定值分别为(725±35),(839±30),(586±40)pg/mL,各组与对照组比较,差别均有统计学意义(P<0.01)。  

　　A:单独培养液; B:LALF 15 μg/mL; C:HMGB1 1 μg/mL; D:HMGB1 1 μg/mL+LALF 5 μg/mL; E:HMGB1 1 μg/mL+LALF 10 μg/mL; F:HMGB1 1 μg/mL+LALF 15 μg/mL. 与C组比较,☆:P<0.05,☆☆:P<0.01.

　　图2  LALF对HMGB1诱导巨噬细胞迁移作用的影响（略）

　　Fig 2  Role of LALF on macrophage migration induced by HMGB1

　　2.2.2  LALF对HMGB1诱导巨噬细胞分泌TNF?α的影响  LALF(5,10,15 μg/mL)与1 μg/mL HMGB1预混合后可剂量依赖性地降低TNF?α的释放,与单独HMGB1的对照组比较,差别有统计学意义(P<0.01)。单独培养液和单纯LALF刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF?α量极低(图3)。

　　HMGB1:晚期炎症因子高迁移率族蛋白?1.  TNF?α：肿瘤坏死因子?α.  A:单独培养液; B:LALF 15 μg/mL; C:HMGB1 1 μg/mL; D:HMGB1 1 μg/mL+LALF 5 μg/mL; E:HMGB1 1 μg/mL+LALF 10 μg/mL; F:HMGB1 1 μg/mL+LALF 15 μg/mL. 与C组比较,☆:P<0.01.

　　图3  LALF对HMGB1诱导巨噬细胞分泌TNF?α的影响（略）

　　Fig 3  Effect of LALF on TNF?α secretion induced by HMGB1

　　3  讨论

　　3.1  LALF对实验动物晚期脓毒症的保护作用  脓毒症指的是由感染引起的全身炎症反应,LPS等成分刺激免疫细胞释放过量的炎症因子是脓毒症死亡的主要原因[6]。鲎抗脂多糖因子是从北美马蹄蟹(美洲鲎)变形细胞提取纯化的一种蛋白质,已知它具有中和内毒素的作用,因此称为内毒素中和蛋白。资料显示,经典的促炎症因子TNF?α和IL?1等在LPS攻击后1～3 h达峰并迅速衰减,6 h基本回落至正常水平[7]。动力学研究也表明,在腹腔注射LPS后24 h时TNF?α血浆浓度下降到峰值的1/10[8]。在促炎症因子消退后给予LALF显然对已知促炎症因子的产生及其直接效应不起对抗作用。因此有理由推测除了具有中和内毒素的活性外LALF可能对某种或某些晚期介质、凝血系统、补体系统等的产生和效应起拮抗作用。

　　3.2  HMGB1对内毒素致死性的晚期介质作用  HMGB1是一种相对分子质量30 kD的蛋白,长期以来对其认识主要局限于它是一种DNA结合蛋白,起着维持核小体结构和调节基因转录的作用。由于其介导炎症反应、参与细胞因子调节的效应不断被发现,现在许多学者已经将HMGB1作为一个特殊成员归属于促炎性细胞因子。与经典的促炎症因子相比,HMGB1具有分泌晚、持续时间长的特点,因而被界定为晚期炎症介质。许多实验证实HMGB1在脓毒症休克中的重要性：(1)脓毒症动物模型、感染及脓毒症引起的器官功能障碍的病人血清中HMGB1水平明显升高[9]。(2)给小鼠注射重组HMGB1,出现脓毒症的典型临床症状,包括发热、不适、肠上皮屏障功能紊乱以及多器官功能障碍等[10]。(3)给予HMGB1抗体能有效预防脓毒症的发生,甚至逆转脓毒症的病理过程[11]。

　　3.3  LALF对HMGB1体外效应的拮抗作用  巨噬细胞是白细胞中功能最为活跃的细胞之一,对内毒素具有强烈的反应性,是机体产生细胞因子及炎症介质的主要细胞。脓毒症时,LPS及TNF?α均可促进单核巨噬细胞等免疫细胞分泌晚期介质HMGB1。本研究用体外实验显示,HMGB1可进一步反作用于巨噬细胞引起TNF?α分泌,构成了炎症因子间的正反馈调节,扩大和促进了炎症反应。大量研究已经证实,HMGB1是引起死亡的晚期介质,在脓毒症发病过程中具有重要作用。可以设想,体内HMGB1促进炎症细胞的趋化作用可能是动物死亡的重要原因之一。同样,推想LALF控制晚期炎症反应的作用机制可能在于LALF对HMGB1这一致死性介质的效应具有抑制作用,表现为LALF可抑制HMGB1诱导的巨噬细胞的趋化作用,以及HMGB1诱导巨噬细胞分泌TNF?α等,从而产生对实验动物的保护作用。这些推想有待实验动物的体内实验加以证实。
   
　　本研究发现LALF可在体外抑制HMGB1的效应,提示其在动物晚期脓毒症中的保护作用的一个可能的机制。这些研究结果为进一步发现、研究LALF在调节免疫防御方面的功能提供了启发,同时也可能为细菌感染时调节天然免疫和炎症反应提供了新的策略。
   
　　(鸣谢:美国马萨诸塞州Woodhole 海洋生物实验室Wainright博士惠赠本实验关键试剂LALF,旧金山加州大学Levin博士对本课题的指导与支持。)

【】
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