孔圣枕中丹对痴呆动物模型抗凋亡作用及机制的研究

【摘要】  目的：研究孔圣枕中丹抗痴呆动物模型海马神经元细胞凋亡的作用及机制。方法：将50只Wister大鼠随机分为正常组、模型组、脑复康组、孔圣枕中丹低剂量组、高剂量组，每组10只。除正常组外，将其余大鼠制成血管性痴呆大鼠模型。给大鼠灌胃后，采用流式细胞技术检测神经元凋亡率及bcl-2的表达，采用免疫组织化学法观察p53的表达。结果：孔圣枕中丹、脑复康均能降低血管性痴呆大鼠脑海马神经元凋亡率和bcl-2表达，提高p53表达，两组比较无显著性差异。结论：孔圣枕中丹能抑制神经元细胞凋亡，其机制可能与增强p53表达、降低bcl-2表达有关。

【关键词】  孔圣枕中丹；血管性痴呆；细胞凋亡；bcl-2；p5

    Abstract   Objective：To observe antiapoptotic effect of Kongsheng Zhenzhong pill on hippocampus neuron of rats with vascular dementia. Methods：50 Wister rats were randomly divided into normal group，model group，Naofukang treatment group，Kongsheng Zhenzhong pill treatment group 1（low dosage），group 2（high dosage）. The apoptosis rate of hippocampus neuron and the expression of bcl-2 were measured by flow cytometry,the expression of p53 was detected by immunohistochemical staining. Results：Compared with the model group，the apoptosis rate of hippocampus neuron and the expression of bcl-2 were decreased，the expression of p53 was increased in Naofukang group and Kongsheng Zhenzhong pill group，but there is no significant difference between Naofukang group and Kongsheng Zhenzhong pill group. Conclusions：Kongsheng Zhenzhong pill can alleviate apoptosis rate of hippocampus neuron through upregulating the expression of p53 and decreasing the expression of bcl-2.

    Key words   Kongsheng Zhenzhong pill; apoptosis; bcl-2; p53; vascular dementia

    血管性痴呆（Vascular Dementia，VD）是由缺血性或出血性及急、慢性缺血缺氧性脑血管疾病引起的认知障碍，以记忆减退、表情淡漠、呆滞或人格改变为主要临床表现，其发病与细胞凋亡有关［1~2］。本实验对中药干预后模型大鼠海马神经细胞凋亡与bcl-2、p53蛋白表达的关系进行了研究，现报道如下。

    1   材料与方法

    1.1   实验材料

    1.1.1   实验动物   清洁级纯系Wister雄性大鼠50只，体重（250±50）g，由山东医科大学动物实验中心提供，合格证号：D20041021。将动物分笼饲养，自由饮水进食，标准饲料喂养， 饲料由山东省实验动物中心提供。

    1.1.2   药品与试剂   孔圣枕中丹的制备：以水为基本溶剂，将龟板、龙骨打碎先煎30 min，再加入其他各药煮沸，浓缩制成100％浓度（相当于生药1 g/mL），置于冰箱4 ℃储存备用。西药对照药品为脑复康（Piracetar），由天津金世制药有限公司生产，批号：20030302，实验前按0.28 g/kg体重配成混悬液备用。凋亡试剂盒Annexin V-FITC Cat.NO.51-6587，PI（Cat No 51-66211E）；Bcl-2试剂盒Fluorescein（FITC）anti-mouse and rat Bcl-2，ebioscience，Cat No.11-6992；p53抗体，santa cruz，Cat No:sc-6243。

    1.1.3   实验仪器   FACSCaliber流式细胞仪，美国BD公司生产（Becton Dickinson），Image pro-plus医学图像处理系统，Olympus显微镜。

    1.2   实验方法

    1.2.1   分组   将大鼠随机分为正常组，模型组，脑复康组，孔圣枕中丹高剂量组、低剂量组，每组10只。

    1.2.2   造模及给药   除正常组外其余大鼠参照改良的四血管夹闭法制备大鼠脑缺血再灌注模型，10%水合氯醛3 mL/kg（体重）腹腔麻醉，取仰卧位，颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，穿线备用，用微型动脉夹关闭双侧颈总动脉10 min，再通10 min，反复3次，撤线，缝合［3］。正常组与模型组用生理盐水灌胃，每日1次；脑复康组灌胃西药脑复康10 mL/kg，孔圣枕中丹高、低剂量组分别给孔圣枕中丹l3.5 g/kg、9.0 g/kg，灌胃给药，每日1次，连续14 d。第15 d用4%多聚甲醛灌注固定后断头取脑备用。

    1.2.3   指标观察

    1.2.3.1   神经元细胞凋亡率检测   各组大鼠断头后迅速取脑组织海马区，制备单细胞悬液，调整细胞数为1×106/mL。吸取100 μL细胞悬液，加5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI，充分混匀细胞，避光25 ℃染色15 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

    1.2.3.2   bcl-2蛋白表达   细胞悬液的制备同1.2.3.1。按细胞内蛋白染色方法，加入20 μL FITC标记的 bcl-2抗体，避光染色30 min，用流式细胞仪检测bcl-2蛋白表达的荧光值。

    1.2.3.3   p53蛋白表达   采用免疫组织化学法检测。脑组织常规固定、包埋、切片，梯度脱蜡、脱水，过氧化氢室温灭活内源性酶，柠檬酸盐溶液微波修复抗原后，血清封闭抗原，滴加适当稀释的一抗，4 ℃过夜。滴加生物素化二抗，37 ℃ 20 min，DAB显色，脱水，透明，封片。选取海马区G1区，图像分析仪上检测平均光密度值。

    1.3   统计方法

    数据统计以SAS软件单因素方差分析进行处理，计量资料数据以均数±标准差（■±s）表示。

    2   结   果

    2.1   孔圣枕中丹对痴呆大鼠神经元细胞凋亡率的影响   结果见表1。由表1可见，给药后脑复康组、孔圣枕中丹低剂量组、高剂量组与模型组比较，海马神经细胞凋亡率明显降低（P＜0.05），但3组之间比较无显著性差异。

    2.2   孔圣枕中丹对痴呆大鼠神经元细胞bcl-2、p53表达的影响   结果见表2。由表2可知，与正常组比较，模型组海马神经细胞bcl-2表达明显降低，p53表达明显增高；与模型组比较，脑复康组、孔圣枕中丹低、高剂量组海马神经bcl-2表达明显增高，p53表达明显降低。但3组之间比较差异无显著性。

    3   讨   论

    细胞凋亡在机体生长发育和维持内环境稳定中起重要作用，凋亡涉及病理性细胞死亡并与多种疾病的发病机制有关［4］。以往人们认为脑缺血后神经细胞死亡形式是坏死，但近年来越来越多的研究表明，缺血诱导的神经元死亡还包括神经元凋亡［5］。缺血性脑损伤后产生大量的自由基、兴奋性氨基酸、NO聚集，并导致细胞内钙超载、诱导细胞凋亡的发生，是痴呆发生的可能机制［6］。凋亡在梗塞灶形成、迟发性神经元坏死（DND）的过程中起着重要作用。因此，对脑缺血后神经元凋亡的研究可进一步了解缺血性脑损伤发生机制，并对其开辟新的途径。

    近年的研究发现，细胞凋亡的发生与bcl-2基因表达有关，其在决定缺血后神经元的生存中起重要作用［7~8］。bcl-2基因家族是凋亡抑制者，脑缺血时抑制细胞死亡的可能机制与其参与磷酸化依赖性调节、自由基产物的局部抑制、线粒体渗透性转运的调节等有关，提示bcl-2表达的增加可能对脑缺血后损伤具有保护作用。过量表达bcl-2的转基因动物已证实了bcl-2的神经保护作用［9］。p53作为转录因子调节多种基因的转录，参与细胞周期调控，参与DNA复制与损伤修复，参与诱导细胞凋亡等。已有大量研究表明：缺血性脑血管病存在DNA损伤及细胞凋亡。因此，p53及其相关基因在脑缺血中的表达调控已成为目前缺血神经元死亡机制中的一个关键性环节。虽然不同的缺血模型中，不同时间不同部位可能存在不同的基因表达调控机制，但目前公认p53是最常见的促凋亡基因，通过激活一系列下游基因发挥促凋亡作用［10］。

    孔圣枕中丹出自《备急千金要方》，方中龟板为血肉有情之品，善补精血，能滋阴潜阳、补肾健骨、补心安神；石菖蒲为开窍醒神豁痰之良药，远志宁心安神，袪痰开窍，龙骨甘涩收敛，能镇惊安神。四药合用，祛痰开窍，补肾安神，是临床治疗血管性痴呆的常用方药［11］。本实验结果表明，模型组大鼠脑神经细胞凋亡率明显增强，而脑复康及孔圣枕中丹组大鼠神经细胞凋亡与模型组比较明显减少，说明孔圣枕中丹有拮抗脑神经细胞凋亡的作用，对痴呆模型大鼠脑内与学习记忆密切相关的海马区的神经元起到了保护作用。细胞凋亡调控基因p53、bcl-2的表达检测结果表明，孔圣枕中丹能降低脑缺血再灌注所致痴呆大鼠海马CA1区p53的表达，并增强bcl-2的表达，说明孔圣枕中丹通过降低p53、提高bcl-2在神经元细胞中的表达而达到抑制神经元细胞凋亡。所以，拮抗缺血性脑病所致痴呆病人神经元细胞的凋亡，可能是孔圣枕中丹改善痴呆症状的主要作用机理，抗凋亡结合其他手段的联合治疗将成为痴呆治疗的主要内容。

【】
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