山莨菪碱治疗兔创伤性急性肺损伤分子生物学机制的实验研究

              作者：简文，樊爱琳，尹文，戚好文，柏长青

【摘要】  目的：探讨山莨菪碱（654?2）对家兔创伤性急性肺损伤（ALI）作用的分子生物学机制. 方法：采用创伤性急性肺损伤模型，将家兔随机分为对照组（CG），肺损伤组（IG）和治疗组（EG），每组24只. 各组动物分别于肺损伤模型建立后1, 2, 3, 4 h各放血处死6只，留取支气管肺泡灌洗液（BALF），分离肺泡巨噬细胞（PAM），用凝胶电泳迁移率改变分析法（EMSA）和RT?PCR法检测PAM中NF?κB的活性变化及TNF?α mRNA的表达水平，用ELISA法检测BALF上清中TNF?α和IL?8的含量. 结果：IG NF?κB活性、TNF?α mRNA表达及TNF?α, IL?8含量于模型建立后1~4 h内均明显高于CG（P<0.01）；EG经山莨菪碱治疗后上述指标与IG相比均有明显下降（P<0.01, P<0.05）. 结论：山莨菪碱对ALI有治疗作用，此作用与其对NF?κB活性及TNF?α mRNA, TNF?α, IL?8表达抑制有关.

【关键词】  山莨菪碱；创伤；急性肺损伤；核因子?κB；细胞因子

    0引言

    TNF?α等细胞因子的释放及其介导的炎症反应在急性肺损伤（acute lung injury, ALI）的发生、中起重要作用［1］. NF?κB是一种基因转录调节蛋白，通过调控TNF?α和白细胞介素等细胞因子的转录，在炎症、免疫、急性期反应中发挥重要作用［2］. 山莨菪碱是一种植物药，在休克、全身炎症反应综合征的治疗中，显示出一定的保护作用［3］. 此类药物在AIL的防治中也有一定的价值，但作用机制尚不明了［4］. 我们采用分子生物学技术对山莨菪碱治疗创伤性ALI时NF?κB活化、TNF?α mRNA表达及BALF中TNF?α, IL?8的释放进行研究，探索其治疗创伤性ALI的可能机制.

    1材料和方法

    1.1材料健康成年家兔，雌雄不拘，体质量2.0～2.5 kg，由本校动物实验中心提供. Lipopolysaccharide（O111:B4，LPS，Sigma）；NE?PERTM试剂盒（Pierce）；Gel Shift Assay 试剂盒（Promega）；γ?32P ATP（北京亚辉生物医学工程公司）；Trizol Reagent（Gibco）；RNA PCR试剂盒（大连Takara）；ELISA试剂盒购自本校基础部免疫学教研室.

    1.2方法健康成年家兔72只，随机分为正常对照（Control group，CG）、创伤性急性肺损伤（Injury group，IG）和山莨菪碱治疗（Experimental group，EG）3组，每组24只. IG, EG动物LPS注射联合撞击，建立创伤性急性肺损伤模型，CG不做胸壁撞击，静注等量生理盐水代替内毒素. EG动物于模型建立后立即予以山莨菪碱2 mg/kg iv，随后以1 mg (kg/h)维持，CG和IG分别予以等量生理盐水，剂量与方法同EG. 各组分别于模型建立后1, 2, 3, 4 h由颈动脉插管放血处死6只动物. 立即行气管插管，用生理盐水分两次行支气管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），5 mL/次，共10 mL，回收率70％左右. 将BALF 1000 r/min离心10 min，沉淀用PBS液洗涤后用RPMI 1640培养液悬浮，置于25 mL培养瓶中，37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养1 h，收集贴壁细胞，计数、瑞氏染色证实为巨噬细胞，纯度>95%，台盼蓝排斥试验鉴定细胞活力>90%.

    1.2.1NF?κB活性的检测用NE?PERTM Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents提取PAM核蛋白，-70℃保存，Bradford法测定蛋白浓度；用γ?32P ATP标记NF?κB寡核苷酸探针(由Gel Shift Assay 试剂盒提供)（5′?AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C?3′,3′?TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G?5′），采用乙醇纯化法纯化，并用凝胶电泳迁移率改变分析法（EMSA）测定NF?κB的活性，用凝胶图像分析系统对放射自显影胶片进行扫描，以各样品与标准品电泳滞后带的光密度比值来表示NF?κB的活性，同时进行特异性及非特异性竞争试验.

    1.2.2TNF?α mRNA表达用Trizol Reagent试剂盒提取PAM总RNA，采用RT?PCR法检测各时间点PAM中TNF?α mRNA水平，参照方法设计特异引物：TNF?α?1：5′?GCT CAC GGA CAA CCA GCT?3′，TNF?α?2: 5′?TCC CAA AGT AGA CCT GCC C?3′，扩增产物332 bp，选用β?actin作内参对照，与TNF?α cDNA一同扩增. 扩增产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统分析，以TNF?α和β?actin扩增产物（177 bp）的光密度比值来反应各组样品TNF?α mRNA的表达水平.

    1.2.3BALF中TNF?α和IL?8含量的检测采用本校免疫学教研室的ELISA Kit进行检测，具体操作按说明书进行.

    统计学处理：各组实验数据以x±s表示，方差分析比较3组动物各采样点有关指标的差异. 采用SPSS12.0版本统计软件包进行统计学处理，P<0.05为差异显著.

    2结果

    IG动物在肺损伤模型建立后均逐渐出现呼吸急促、躁动、紫绀等症状，呼吸频率从30~55次/min升至90~120次/min. EG动物上述症状明显轻于IG，其呼吸频率维持在80次/min以下，CG动物较安静，未出现上述症状，呼吸频率基本稳定在30~50次/min.

    2.1兔PAM中NF?κB的活性CG动物NF?κB活性在实验期间稳定在0.2以内. IG于模型建立后1～4 h内NF?κB活性均明显高于CG（P<0.01），在2 h达到高峰，是同期CG的8倍. EG经山莨菪碱后，NF?κB活性虽然高于CG组，但明显低于IG（P<0.01），其中2 h降幅最大，达30.2％（图1）.

    图1兔PAM中NF?κB的活性变化

    2.2兔PAM中TNF?α mRNA的表达IG在模型建立后1 h TNF?α mRNA的表达即开始上升，但峰值时间较NF?κB滞后1 h，是同期CG的5倍，4 h TNF?α mRNA的表达较前有所下降，但仍明显高于CG（P<0.01）. EG经山莨菪碱治疗后各时间点TNF?α mRNA的表达较IG均有明显下降（P<0.01，P<0.05），最大降幅出现在2 h，达34.5%（图2）.

    图2兔PAM中TNF?α mRNA的表达

    2.3兔BALF中TNF?α和IL?8的含量IG在模型建立1 h后BALF中TNF?α和IL?8含量即开始上升，3~4 h达到高峰，明显高于CG（P<0.01），与同期PAM中TNF?α mRNA表达水平的变化相一致. EG经山莨菪碱治疗后各时间点BALF中TNF?α, IL?8含量较IG相比均有明显下降（P<0.01，P<0.05），最大降幅分别出现在3, 4 h，为30.7%, 35.7%（表1）. 表1兔BALF中TNF?α及IL?8的含量

    3讨论

    机体受到创伤、感染、休克等多种原因刺激后，可引起全身炎症反应综合征（systemic inflammation response syndrome, SIRS）导致ALI和ARDS，创伤和感染是两个重要因素，其发病机制复杂，涉及众多炎症介质及细胞因子［5-6］. NF?κB是参与炎症反应的重要信号转导分子，通常与抑制蛋白IκB结合成无活性形式存在于胞质中，当细胞受感染、氧化剂等刺激后，IκB被水解，使NF?κB的核定位序列暴露，与多种炎症介质（TNF, IL?1, IL?6, IL?8等）基因启动子或增强子中存在的κB序列结合，启动和调节其基因转录，与ALI关系密切［7］. 我们发现：肺损伤模型组动物在撞击及注射LPS后1～4 h内NF?κB活性明显高于对照组（P<0.01），高峰出现在模型建立后2 h. PAM中TNF?α mRNA的表达水平在模型建立后1～4 h内较对照组亦有显著升高（P<0.01），其高峰出现在3 h. 同时，BALF中TNF?α, IL?8的含量与对照组相比也有明显升高（P<0.01）. NF?κB活性和TNF?α mRNA表达峰值水平的先后顺序性提示：创伤及LPS引起PAM中TNF?α释放增加的机制可能是创伤及LPS的刺激可活化PAM中的NF?κB，后者可上调TNF?α的基因转录和蛋白合成，从而激发逐级放大的瀑布样链锁反应.

    山莨菪碱是从植物中提取的一种生物碱，临床广泛用于治疗感染性休克、平滑肌痉挛、微循环障碍及各种神经痛等疾病［3］. 近年来用于防治ALI，显示出良好的效果，但具体作用机制不明［4,8］. 本实验结果显示：对创伤性ALI家兔给予山莨菪碱治疗可有效缓解家兔呼吸困难、紫绀等症状，显著降低 PAM中TNF?α mRNA的表达及BALF中TNF?α和IL?8的含量（与损伤组比较，P<0.01，P<0.05），其最大降幅出现在2～3 h，并且可明显抑制PAM中NF?κB的活化（P<0.01，P<0.05），其最大降幅出现在2 h，较TNF?α的最大抑制时间提前. 以上结果提示：山莨菪碱对TNF?α及其下游细胞因子的抑制作用可能是通过NF?κB实现的，NF?κB可能是山莨菪碱体内作用的靶因子之一.

    山莨菪碱通过对PAM中NF?κB活化的抑制，下调了TNF?α基因的转录及蛋白的合成，从而减少了BALF中TNF?α及后续细胞因子IL?8的释放，从源头阻遏了炎性细胞因子的瀑布样链锁反应，对ALI的发生与具有抑制作用. 至于山莨菪碱是通过什么途径来抑制NF?κB的活化以及具体机制如何，尚待进一步研究.

【】
  ［1］ Leaver SK, EvansTW. Acute respiratory distress syndrome［J］. BMJ,2007,335(7616):389-394.

［2］ Miskolci V, Rollins J, Vu HY, et al. NF?kappa B is persistently activated in continuously stimulated human neutrophils［J］.Mol Med, 2007,13(3?4):134-142.

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［4］ 杨国栋,姚新民.莨菪类药治疗急性肺损伤的探索和药基础［J］.急救医学,2004, 24(4):281-283.

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［8］ 尹文,虎晓岷,黄杨.山莨菪碱对创伤性肺损伤炎症反应的干预研究［J］.中国医学杂志，2003,13(11):30-33.