动态种植法提高在去细胞猪瓣支架上种植内皮细胞效率和均匀性的研究

              作者：顾春虎, 王云雅, 易定华, 魏旭峰, 董小超, 刘洋, 金艳, 孙国成    

【摘要】  目的: 尝试使用简单的动态种植方法来提高内皮细胞在去细胞牛心包支架上的种植效率和均匀性,以更有效地构建组织工程瓣膜. 方法:采用胰酶－去垢剂法制备去细胞牛心包. 内皮细胞以下列方式在去细胞牛心包支架进行种植和培养: ①振荡种植振荡培养(OO); ②振荡种植静止培养(OS); ③静止种植静止培养(SS). 定期取样品进行电镜、组织学检测及细胞计数分析. 结果:细胞加入24 h后振荡种植的样品比静止种植的样品细胞在支架内分布更为均匀,同时振荡种植的样品细胞贴壁率［ (36±3) %］高于静止种植的样品细胞贴壁率［(21±2)%, P<0.05］. 振荡种植振荡培养的样品在培养过程中细胞脱离支架而死亡,因此放弃了这些样品的继续培养. 振荡种植静止培养的样品和静止种植静止培养的样品细胞一直保持正常的伸展状态. 在培养过程中支架上的活细胞总数振荡种植静止培养的样品一直高于静止种植静止培养的样品. 结论:采取振荡种植的方式种植细胞可明显提高内皮细胞在三维支架上种植的效率和分布均匀性.

【关键词】  内皮细胞;振荡种植;静止种植;振荡培养; 静止培养

    0引言

    种子细胞在支架上的种植是利用组织工程技术构建组织工程瓣膜的第一步,因此在组织工程瓣膜构建中发挥着重要的作用. 体外在不同材料上构建不同组织的研究已证实,所构建组织的匀质性与细胞在支架上最初分布的均匀性密切相关［1］. 目前,在静止条件下把高密度细胞悬液加在支架表面(静止种植) 是应用的较为普遍的一种细胞种植方式. 但这种方法有细胞种植率低［2］ 和细胞在支架内分布不均匀［3-4 ］的缺点.

    搏动反应器种植、搅拌瓶反应器种植等已被成功地应用于某些实验研究中, 达到了提高细胞种植的效率和均匀性的目的. 由于在组织构建的过程中多种原因影响着组织的形成,因此构建不同的组织要求不同的种植培养条件［5 ］. 所报道的一些动态种植培养方法需要特定昂贵的实验装置,因此具有一定的局限性. 本研究我们使用简单的动态种植的方法在去细胞支架上种植内皮细胞并对种植效果进行了检测和分析.

    1材料和方法

    1.1材料SD大鼠,4周龄,清洁级,雌雄不限,体质量(250±20) g,购于第四军医大学实验动物中心;DMEM培养基,胰酶购于Sigma公司;MTT, DMSO购于美国Parmacia公司；LG?小牛血清购于美国Hyclone公司、兔抗鼠Ⅷ因子mAb（武汉Boster公司）.

    1.2方法

    1.2.1去细胞猪主动脉瓣的制备新鲜屠宰猪的主动脉瓣，立即置入装有4℃ Hank?s溶液中. 尽量剔去猪的主动脉外脂肪，浸入4℃ Hank?s溶液中洗涤5 min×3次（青霉素50 g/L, 链霉素5 U/mL）. 然后按［6］方法制备去细胞猪主动脉瓣. 组织标本常规40 g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色后观察.

    1.2.2大鼠内皮细胞体外增殖模型建立大鼠颈椎脱臼法处死后,取出胸主动脉,组织贴块法原代培养，扩增后［7］, 经Ⅷ因子免疫细胞化学染色鉴定确为内皮细胞,采用5～10代细胞为实验对象.

    1.3细胞在支架上的种植和培养将去细胞瓣膜支架用DMEM 培养液在24孔细胞培养板中预先浸泡24 h,然后吸净培养液. 吸取0.1 mL浓度为1.0×1010个细胞/L内皮细胞悬液加入去细胞瓣膜支架上, 将培养板密封并分为3组,分别采取不同的方式进行种植和培养:①静止种植静止培养: 密封的培养板被转移到37℃培养箱中,12 h加入2 mL培养基,密封,重新转移到37℃培养箱中静置培养. ②振荡种植静止培养: 密封的培养板被转移到恒温旋转振荡器中37℃, 30 r/min 振荡种植,12 h后加入培养基2 mL,密封,然后转移到37℃培养箱中静态培养. ③振荡种植振荡培养: 动态种植的样品加入2 mL培养基后仍置于旋转振荡器中, 37℃, 30 r/min振荡培养. 所有样品每2 d更换1次培养液.

    1.4组织学、形态学检测及细胞种植分析分别于细胞加入支架后的24 h, 3 d, 5 d, 7 d取样品用PBS冲洗,去除未贴壁细胞,然后用2.5 g/L胰酶消化10 min, 800 g离心6 min收集细胞计数进行细胞计数分析. 常规固定,分别进行电镜观察和HE 染色观察.

    统计学处理: 细胞计数用x±s表示,组间比较采用t检验，P<0.05为有统计学意义.

    2结果

    2.1SD大鼠胸主动脉内皮细胞的原代培养和鉴定SD大鼠胸主动脉内皮细胞在原代培养1 d后，可以见到细胞均贴壁伸展，成片生长，呈短梭形、短圆形或多角形，无长的不规则细胞突起，细胞之间紧密衔接，连接成片，7~8 d后呈铺路石样（图1A）；Ⅷ因子免疫组化染色，为阳性（图1B）.

    A: 倒置显微镜; B: Ⅷ factor免疫组化染色.

    图1内皮细胞种植去细胞瓣膜支架×200

    2.2细胞种植分析细胞加入支架24 h后已经开始在支架上分布和伸展. 但是静止种植的样品细胞在支架上分布不均匀,有些区域细胞聚集形成了大量的细胞团块,而有些区域则缺乏细胞. 相反,振荡种植的样品细胞在整个支架上分布的更为均匀. 从细胞种植的效率来看,振荡种植的样品细胞密度明显高于静止种植的样品. 细胞加入支架24 h后振荡种植的样品细胞贴壁率为(36%),而静止种植的样品细胞贴壁率为(21%), 两者比较有显著性差异(P<0.05, 表1). 表1内皮细胞在支架上的贴壁及增殖

    2.3细胞形态学观察在培养过程中振荡种植静止培养的样品(图2A)和静止种植静止培养的样品细胞一直保持正常的伸展状态(图2B). 但是振荡种植振荡培养的样品在培养3 d时有部分细胞形态发生了改变,从正常的伸展状态开始变圆回缩,并有细胞已脱离支架而死亡. 在培养5 d时此种样品中更多的细胞脱离支架而死亡,经过3 次重复实验,出现同样的现象,因此,放弃了这些样品的继续培养.

    2.4细胞增殖分析实验结果显示,在培养过程中细胞计数显示振荡种植静止培养的样品细胞数在培养1～7 d内一直明显高于静止种植静止培养的样品(表1),在培养7 d时,振荡种植静止培养的样品细胞数要比静止种植静止培养的样品细胞数高出近2倍. 同时HE染色结果显示,在培养7 d时静止种植并且静止培养的样品支架只有少量的细胞(图3A),而振荡种植静止培养的样品有大量细胞在支架生长(图3B).

    3讨论

    构建组织工程人工瓣膜,细胞种植时内皮细胞在支架上的均匀分布将为形成具有均匀性的组织提供基础. 同时较高的细胞种植效率可以减少在构建自体移植组织时从取材到移植所需要的时间,并更有效的利用供体组织.

    采用静止种植方法导致的细胞种植率低［2］和细胞在支架内分布不均匀［3-4 ］的问题不仅在瓣膜等组织中出现,在皮肤组织工程的其他领域同样存在着类似的问题. 因此为了提高细胞种植的效率和均匀性,人们已尝试了各种方法. 已有报道灌注条件下可以提高关节软骨细胞的种植效率,并促进关节基质的形成［7］. 而当在聚羟基乳酸无纺网中种植细胞时在搅拌瓶反应器中种植可获得更多的贴壁细胞,同一项研究表明,通过细胞在三维支架空隙中的流动种植使得细胞在支架中的分布比静止种植具有更高的均匀性［2］. 虽然这些技术已被成功地应用于某些实验研究中,但在整个组织工程领域这些技术并未被广泛使用. 这是由于在组织构建的过程中多种原因如温度、pH、氧气、细胞数量等影响着组织的形成. 同时动物细胞、组织种类的多样性,使得细胞培养材料、培养环境千差万别,因此构建不同的组织要求不同的种植培养条件［5］. 而且,已报道的一些动态种植培养方法由于需要特定的昂贵的实验装置而限制了这些方法的广泛应用. 我们尝试：用空气恒温振荡器振荡种植的方法种植内皮细胞,并对细胞在三维支架上种植的效率和均匀性进行检测和分析.

    结果显示,振荡种植的效率明显高于静止种植的效率,振荡种植静止培养的样品中细胞数一直明显高于静止种植静止培养的样品,表明细胞增殖状态良好. 种植效率的区别可能是因为静止和振荡状态下细胞氧气和营养物质供应量的不同造成的. 在静止状态下,氧气和营养物质的供应是依靠扩散进行的;而在振荡条件下氧气和营养物质的供应可同时依靠扩散和对流进行,因此更为有效. 所以在振荡条件下,由于细胞获得了更多的氧气和营养物质,细胞活性更高,种植效率也更高［7-8］. 另外振荡所产生的机械动力也可能促进了细胞的均匀分散,因此有更多的细胞可以贴附于支架上,进而提高了细胞的贴壁率. 同时振荡种植比静止种植使得细胞在支架内的分布更加均匀. 振荡条件下支架各部位的细胞密度没有明显区别. 静态种植细胞的不均匀分布有可能是由于重力作用以及细胞的活动造成的. 振荡种植振荡培养的样品在培养过程中出现的细胞从支架上脱落可能是由于细胞本身的生长特性造成的,在细胞种植开始不适应体外振荡培养.

    　　【】
  ［1］ Holy CE, Shoichet MS, Davies JE. Engineering three dimensional bone tissue in vitro using biodegradable scaffolds: Investigating initial cell seeding density and culture period［J］. J Biomed Mater Res, 2000,51:376-382.

［2］ Li Y, Ma T, Kniss DA, et al. Effects of filtration seeding on cell density, spatial distribution, and proliferation in nonwoven fibrous matrices［J］. Biotechnol Prog, 2001,17:935-944.

［3］ Burg KJ, Delnomdedieu M, Beiler RJ, et al. Application of magnetic resonance microscopy to tissue engineering: A polylactide model ［J］. J Biomed Mater Res, 2002,61:380-390.

［4］ Xie Y, Yang ST, Kniss DA. Three?dimensional cell scaffold constructs promote efficient gene transfection: Implications for cell based gene therapy［J］. Tissue Eng, 2001,7:585-598.

［5］ Carrier RL, Rupnick M, Langer R, et al. Perfusion improves tissue architecture of engineered cardiac muscle ［J］. Tissue Eng, 2002,8:175-188.

［6］ Gu CH, L WY, Yi DH, et al. Primary study on cell extraction from porcine aortic valve［J］. Natl Med J China, 2005, 85: 1827-1830.

［7］ 李琴山,冯赞杰,刘洋, 等. 一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法［J］. 第四军医大学学报，2007，28(3): 276-278.

［8］ Wendt D, Marsano A, Jakob M, et al. Oscillating perfusion of cell suspensions through three dimensional scaffolds enhances cell seeding efficiency and uniformity ［J］. Biotechnol Bioeng, 2003,84:205-214.

［9］ Ratcliffe A, Niklason LE. Bioreactors and bioprocessing for tissue engineering［J］. Ann N Y Acad Sci, 2002,961:210-215.