rhBMP?2m在高浓度条件下的复性

               作者：王馥丽,陈苏民,陈南春,赵玮钦    

【摘要】  目的： 优化高浓度的人骨形成蛋白2成熟肽（rhBMP?2m）的复性条件. 方法： 将工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达，裂菌收集包涵体后经离子交换色谱分离纯化. 纯化后的蛋白在不同的温度、复性液pH, 氧化交换系统浓度、盐浓度等条件下进行透析复性. 透析复性后进行非还原的SDS?PAGE, 检测rhBMP?2m活性形式二聚体的含量，同时找出相对较优的复性方法对复性产物进行0.22 μm微孔滤膜除菌并其损失率. 结果： 经透析复性后rhBMP?2m完全可溶，而且其活性形式二聚体的含量达到30%左右，即复性后二聚体的rhBMP?2m可以达到每升发酵液800 mg，并且经微孔滤膜除菌后rhBMP?2m活性形式二聚体的含量基本没有损失，同时蛋白定量也表明过滤除菌后蛋白损失不超过10%. 结论： 高pH有利于rhBMP?2m的复性，除变性剂尿素时采用低pH可以保持高浓度rhBMP?2m复性后仍保持可溶. 蛋白质的浓度、pH和温度对蛋白复性的结果影响很大，但盐浓度、氧化交换系统的浓度和透析外液体积对蛋白复性影响不是很大.

【关键词】  重组人骨形成蛋白2成熟肽;蛋白质/分离和提纯；蛋白质复性

　　0引言

　　骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP) 是转化生长因子β (transforming growth factor?beta, TGF?β) 超家族的成员, 是广泛分布于 动物骨组织的酸性蛋白质, 在修复骨质缺损和促进骨折愈合等方面发挥重要作用［1］，其诱导成骨的活性很强，是骨骼系统形成和正常发育所必不可少的因子［2］. 目前，重组人骨形成蛋白2成熟肽(recombinant human bone morphogenetic protein?2 mature peptide，rhBMP?2m) 已经被商业化生产并应用在多种临床研究中，包括骨质缺损、颌面修复等. 但由于利用哺乳动物细胞制备rhBMP?2m，其表达水平很低，纯化过程复杂，使得产品价格高昂，制约着其推广应用［3］. 虽然从大肠杆菌制备BMP产量高、成本低，但由于BMP活性形式是由含有3对二硫键的成熟肽肽链再以二硫键连接而成的二聚体［4］，而且BMP含有两个伸展的非极性片段［5］，具有很强的疏水性容易沉淀，使BMP复性的难度很大，目前所报道的复性方法［6］，在线复性［7］等用于rhBMP者都还有待改进. 本研究探索和优化rhBMP?2m的复性条件，试图提高复性的二聚体产量，以解决rhBMP?2m疏水难溶、不能过滤除菌等难题.

　　1材料和方法

　　1.1材料菌种DH5α/pDH2?rhBMP?2m由本教研室构建并保存; BioFloⅣ型15 L全自动发酵罐（美国NBS公司）；SP?Sepharose FF, Q?Sepharose FF（Pharmacia公司）；透析膜(截留分子质量10 000)（华美公司）；低温高速离心机（湘西仪器仪表厂）；超声细胞粉碎仪JY98?3（宁波新芝科仪研究所）；SDS?PAGE垂直平板电泳系统（BIORED公司）；溶菌酶（Invitrogen）去氧胆酸钠（上海伯奥生物科技有限公司）；TritonX?100（FARCO CHEMICAL）；DNAase I, SDS（SIGMA公司）；丙烯酰胺、N?N?亚甲基双丙烯酰胺、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、尿素、β?巯基乙醇等均为分析纯国产试剂, （天津化学试剂六厂和沈阳化学试剂厂）；BCA蛋白定量试剂为本实验室配制；Low protein marker，标准蛋白（上海生物化学研究所）.

　　1.2方法

　　1.2.1DH5α/pDH2?rhBMP?2m高密度发酵采用恒溶氧高密度发酵方法［8］.  取-70℃保存的DH5α/pDH2?rhBMP?2m工程菌株甘油菌种，划LB琼脂平板，含100 μg/mL氨苄青霉素，32℃培养20 h. 挑单菌落接入6 mL LB培养基中，30℃摇床培养16 h. 转入300 mL LB，30℃摇床培养10 h. 转入15 L发酵罐，计算机自动控制搅拌、通气溶氧，30℃继续培养16 h. 发酵罐内42℃诱导表达4 h，结束发酵，6000 r/min 离心收菌.

　　1.2.2裂菌、包涵体纯化用裂解缓冲液(100 g/L蔗糖,10 mmol/L pH 8.0 Tris?HCl，1 mmol/L EDTA)悬浮发酵所得到的菌体，置冰浴中，按3 mg/g湿菌加入溶菌酶裂菌，16 000 g离心后收得包涵体. 按每克湿沉淀加入3 mL包涵体洗涤液(5 g/L TritonX?100，10 mmol/L pH 8.0 Tris?HCl，1 mmol/L EDTA)悬浮包涵体，超声处理，1360 W，9 s，间歇6 s，20个循环. 16 000 g离心收集包涵体,反复4次.

　　1.2.3离子交换层析纯化rhBMP?2m① SP?Sepharose FF阳离子柱层析分离： 洗涤后的包涵体溶解于pH 6.5的SP?buffer(8 mol/L尿素，20 mmol/L pH 6.5磷酸钠缓冲液，0.014 mol/L β?巯基乙醇)中，充分溶解后上SP?Sepharose FF阳离子柱，用适合浓度的NaCl溶液洗脱，收集蛋白峰，透析除去尿素β?巯基乙醇，离心收集沉淀. ② Q?Sepharose FF阴离子柱层析纯化： 将SP?Sepharose FF柱层析纯化的蛋白质沉淀溶解于pH 9.0的Q buffer(8 mol/L尿素，20 mmol/L pH 9.0 Tris，0.014 mol/L β?巯基乙醇)中，充分溶解后上Q?Sepharose FF阳离子柱，用适合浓度NaCl溶液洗脱，收集蛋白峰，透析除去尿素和β?巯基乙醇，离心收集沉淀.

　　1.2.4蛋白复性纯化后的rhBMP?2m经变性液(8 mol/L尿素，20 mmol/L pH 6.5磷酸钠缓冲液，0.014 mol/L β?巯基乙醇)溶解，装入透析袋内，对不同的透析外液进行透析复性. 各种复性液的组成（表1）. 复性后，逐步透析除去尿素和β?巯基乙醇. 最后收集复性蛋白液，复性的蛋白液可通过0.22 μm微孔滤膜除菌，或进一步浓缩和冰冻干燥.

　　1.2.5蛋白定量用NaOH 0.1 mol/L将BSA标准品(1 μg/mL)稀释成梯度浓度：1000，800，600，400，200，0 μg/mL，同样将蛋白样品倍比稀释至适当浓度(0～1000 μg/mL). 样品、梯度标准品各50 μL，分别加入200 μL工作液(工作液A和B以50∶1的比例均匀混合)，混匀后37℃水浴30 min，以ELISA reader测A562 nm(或A570 nm)吸光度值. 作图画出标准曲线，并决定未知样本的浓度.

　　1.2.6过滤除菌筛选出合适的复性条件，然后将复性后的rhBMP?2m经0.22 μm微孔滤膜除菌，对通过微孔滤膜前后的液体进行蛋白定量，并计算其损失率.

　　2结果

　　2.1rhBMP?2m的发酵及包涵体纯化发酵罐中DH5α/pDH2?rhBMP?2m培养16 h和诱导表达4 h后，测发酵液A600 nm=60.5. 发酵液中rhBMP?2m占细菌总蛋白量的20%. 蛋白定量后测算发酵液中rhBMP?2m为3.2 g/L. 经洗涤的包涵体中rhBMP?2m纯度为70%. 包涵体经SP?Sepharose FF柱层析，目的蛋白出现在0.28 mol/L及0.78 mol/L的氯化钠溶液洗脱峰内. 蛋白回收率为60%，rhBMP?2m纯度为85%. 经SP?Sepharose FF柱层析后的蛋白经Q?Sepharose FF柱层析纯化，目的蛋白位于0.06 mol/L的氯化钠洗脱峰内. 透析除去尿素，离心收集蛋白，蛋白回收率为85%，rhBMP?2m的纯度达到95%. 经阳离子和阴离子柱纯化后，目的蛋白的回收率为30%.

　　2.2rhBMP?2m的透析复性经不同复性缓冲液透析复性后进行非还原SDS?PAGE，然后进行灰度扫描，得到结果（表1）.

　　表1不同复性液的组成及复性后蛋白各组分的比率（略）

　　复性液12透析复性后的产物为可溶性，复性产物中二聚体含量占总蛋白量的30%左右. 同时得到非还原的SDS?PAGE结果（图1）

　　M: marker; 1: 复性前; 2: 复性后.

　　图1复性液12的复性产物非还原SDS-PAGE分析（略）

　　2.3过滤除菌复性液12透析复性的rhBMP?2m经0.22 μm微孔滤膜除菌，所得到非还原SDS?PAGE结果（图2）. 灰度扫描提示二聚体的含量基本没有变化，同时蛋白定量也提示复性后rhBMP?2m经0.22 μm微孔滤膜除菌后蛋白损失不超过10%.

　　M: marker; 1: 复性后; 2: 复性后经过滤除菌; 3: 复性前.

　　图2复性液12的复性产物经过滤除菌后的非还原SDS-PAGE分析（略）

　　3讨论

　　人BMP?2由1186 bp编码的396个氨基酸组成，包括信号肽，前肽和成熟肽，该蛋白经翻译合成分泌后，其N端20多个氨基酸分泌信号肽即被切去. 前体蛋白经内切蛋白酶降解，产生由C端114个氨基酸组成的成熟蛋白质. 其成熟肽具有很强的诱骨活性，在胚胎时期的骨骼形成中起关键作用［9］. BMP?2成熟肽与TGF?β超家族的其他成员一样形成同源二聚体. 其单体含有7个半胱氨酸残基，其中的6个形成三对单体内的二硫键，剩下的一个形成链间二硫键，从而使两个单体连接形成二聚体. rhBMP?2m含有大量疏水性氨基酸残基，蛋白的溶解度差，不利于对复性蛋白进行分离和过滤除菌. 采用射线照射、环氧乙烷熏蒸等［10］办法杀菌则造成蛋白活性丧失.

　　包含体中的多数蛋白不能正确折叠，没有活性. 虽然已有多种蛋白的包含体被正确复性，但不同的蛋白需要不同的复性条件，研究特定蛋白的复性条件是一件复杂而又困难的任务［11］. 但不同蛋白复性的核心内容均是在控制蛋白质复性环境的基础上，如pH,蛋白质浓度、温度、离子强度等，通过添加化学物质，延长复性时间或其他方法来稳定并抑制蛋白质中间体的相互聚集，同时促进蛋白质内部必要化学键的形成，以恢复正常的空间构象，尽量减少蛋白质复性过程中由于中间体之间的粘连导致的沉淀发生. BMP?2是内部含有多个二硫键的小分子蛋白因子，对于此类蛋白质，恢复分子内部二硫键的正确搭配是蛋白质复性的关键所在. 可以使用Cu2+诱导的空气氧化法来促进二硫键的形成［12］，或是在复性液中加入一定浓度的氧化还原系统，如半胱氨酸/胱氨酸，GSH/GSSG或DTT/GSSG等以促进正确的二硫键的形成［13］. 已有的对rhBMP?2m复性的报道均是采用低浓度蛋白的稀释复性［14］. 但低浓度稀释复性不利于蛋白的回收，不仅工作量大不利于放大，更严重的是浓缩过程常使疏水性强的rhBMP?2m丢失殆尽，因而采用低浓度蛋白复性的报道常回避浓缩回收rhBMP?2m的问题. 而本组前期高pH环境下透析复性rhBMP?2m［15］，也没有解决rhBMP?2m可溶性问题. 本实验采用改变pH的透析复性，使得高浓度（6 mg/mL）rhBMP?2m透析复性后活性形式二聚体的含量达到30%，即复性后蛋白达到800 mg/L发酵液，与已报道的经稀释复性得到的750 mg/L发酵液［16］相差无几,且复性后蛋白完全可溶. 比较成功地解决了复性后蛋白的可溶性问题，经微孔滤膜除菌损失小于10%. 另外本实验采用的高蛋白浓度的复性均有利于复性产物的回收和后续的大规模工业化生产. 本实验还对影响复性的不同的因素进行了优化组合，发现蛋白质的浓度、pH、温度对蛋白复性的结果影响很大，但盐浓度、氧化交换系统的浓度和透析外液体积对蛋白复性影响不是很大. 本研究从不同的组合中找出相对较好的对以包含体形式表达的rhBMP?2m的复性方案后，其复性产物经微孔过滤除菌，rhBMP?2m损失不大. 因此我们认为在高pH下复性后在低pH下透析除尿素可以得到可溶性的复性后蛋白，提示我们在其他的蛋白复性中也可采用改变pH的方法来得到可溶性的蛋白. 同时我们还将继续进行复性后rhBMP?2m的小鼠肌袋活性和细胞活性的检测.

【】
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