六味抗衰饮对衰老模型大鼠线粒体DNA含量及氧自由基的影响

【摘要】  目的： 从肝细胞线粒体DNA（mtDNA）和氧自由基的角度，探讨六味抗衰饮延缓衰老的可行性和可能的作用机制，为临床提供实验依据. 方法： 将36只SD大鼠随机分成3组，每组12只，即青年对照组、衰老模型组、六味抗衰饮组. 衰老模型组、六味抗衰饮组给予D?半乳糖溶液造模，青年对照组给予生理盐水. 六味抗衰饮组在造模的同时给予，青年对照组和衰老模型组给予等体积生理盐水灌胃，连续40 d. 检测肝细胞mtDNA的相对含量、血清SOD活性及MDA含量作比较. 结果： 六味抗衰饮能够降低衰老状态下大鼠肝细胞mtDNA相对含量及血清MDA含量，提高血清SOD活性（P<0.05）. 结论： 六味抗衰饮组具有减轻D半乳糖诱导亚急性衰老动物模型的氧化损伤，保护肝细胞mtDNA，从多方面延缓机体衰老的作用.

【关键词】  衰老 六味抗衰饮 DNA 线粒体 氧自由基 大鼠

　　0引言

　　中医学对衰老的观察和在延缓衰老方面的实践有着悠久的，历代医家多用补肾为主的方药来延缓衰老. 在实践中我们发现，脏腑虚衰与痰浊、积滞、瘀血互为因果不断恶性循环，是导致衰老的重要因素［1-3］, 据此立法创制了六味抗衰饮.在过去的研究中，我们观察到本方能明显改善老年患者倦怠健忘、头晕失眠、便秘等症状.本实验观察了六味抗衰饮对D?半乳糖致衰大鼠肝细胞线粒体DNA及氧自由基的影响.

　　1材料和方法

　　1.1材料SD大鼠36只，雌、雄各半，清洁级，鼠龄2 wk左右，体质量200~220 g，贵阳医学院动物中心提供. D?半乳糖由上海恒信化学试剂有限公司提供. 肝细胞mtDNA提取所需试剂由贵阳医学院设备供应科和昆明绿盟试剂公司提供. SOD活性及血清MDA含量测定所需试剂盒由南京建成生物工程研究所提供. 低温高速离心机（德国Heraeus Biofuge 22R），紫外分光光度计（日本岛津UV?365）. 六味抗衰饮（红参10 g，枸杞子15 g，决明子15 g，三七花10 g，玫瑰花10 g，绞股蓝20 g）由贵阳医学院附属中药房提供，常规水煎两次，药液经纱布过滤后混合并浓缩至1 g生药/mL，4℃保存.

　　1.2方法

　　1.2.1衰老动物模型建立［1］及中药治疗将实验大鼠随机分成3组，每组12只，即青年对照组、衰老模型组、六味抗衰饮组. 将大鼠适应性喂养1 wk后，衰老模型组、六味抗衰饮组每日按公斤体质量皮下注射D?半乳糖溶液125 mg/（kg·d），青年对照组每日皮下注射等量生理盐水1次，连续40 d. 六味抗衰饮组在造模的同时按每日1.5 g/100 g灌胃给药，青年对照组和衰老模型组给予等体积生理盐水灌胃，连续40 d.

　　1.2.2血清及标本制备实验40 d时各组动物禁食过夜，将大鼠固定好，剪开腹股沟动脉处皮毛，局部消毒，分离并剪断腹股沟动脉，取血3 mL，3000 r/min，离心10 min，吸取血清用于SOD活性及MDA含量测定. 采血后，断颈处死大鼠，立即剖腹取出肝脏，剥离干净、生理盐水冲洗、滤纸吸干、液氮冻存（-196℃）备用，用于测定mtDNA含量.

　　1.2.3肝细胞mtDNA含量检测［2］采用碱变性法提取肝细胞mtDNA,采用紫外分光光度法测定其含量.

　　1.2.4血清氧化指标检测按试剂盒所述方法测定大鼠血清SOD活性、MDA含量.

　　统计学处理： 实验数据均x±s表示，用SPSS11.5统计软件进行统计分析，均数比较采用方差分析及LSD?t检验，P<0.05为有统计学意义.

　　2结果

　　2.1大鼠肝细胞mtDNA相对含量的变化造模40 d后，衰老模型组与青年对照组比较，肝细胞mtDNA相对含量升高，差异有统计学意义（P<0.05）；六味抗衰饮与衰老模型组比较，肝细胞mtDNA相对含量降低，差异有统计学意义（P<0.05，表1）.

　　2.2大鼠血清SOD活性、MDA含量变化造模40 d后，衰老模型组与青年对照组比较，血清SOD活性明显降低，血清MDA含量升高，差异有统计学意义（P<0.05）；六味抗衰饮组与衰老模型组比较，血清SOD活性明显升高，血清MDA含量降低，差异有统计学意义（P<0.05，表1）.

　　表1大鼠肝细胞mtDNA相对含量和血清SOD活性、MDA含量变化（略）

　　aP<0.05 vs 青年对照； cP<0.05 vs 衰老模型.

　　3讨论

　　衰老涉及机体的多个系统和器官，是一个多基因、多因素参与的复杂过程. 近年来，“衰老线粒体学说”已逐渐成为衰老理论的研究热点［3-4］, 自1989年 Linnane等提出线粒体衰老假说，人们就开始关注线粒体DNA与衰老关系的研究.体细胞mtDNA裸露于基质，缺乏结合蛋白的保护，最易受伤害发生突变，mtDNA突变导致翻译多肽链错误，由此可引起线粒体膜结构和功能损伤，使呼吸链功能受损，是机体衰老的重要原因之一. 但是，以往的研究大都关于突变，与年龄增长相关的mtDNA含量的变化报道较少. 本研究结果表明，衰老模型组大鼠肝细胞mtDNA的含量明显高于青年对照组（P<0.05），由此推测mtDNA含量在老年期是增多的. 吴小晶等［5］认为其含量增加的可能机制为： （1）代谢反馈机制.认为与衰老相关线粒体功能的缺陷，一方面通过增加未受损的正常线粒体工作量来进行代偿，另一方面反馈刺激细胞增加线粒体的含量来代偿. （2）快速复制机制.不同类型线粒体DNA的缺失，使其基因组减少，而这种较正常线粒体DNA短而有缺失的线粒体DNA，具有一种复制的优势，结果造成细胞内大量无功能线粒体DNA的堆积. （3）调节失控机制.野生型线粒体DNA顺式控制作用因基因突变而被抑制或失活，这样突变型线粒体DNA的量就超过野生型，导致与细胞能量状态及代谢需要无关的突变型线粒体DNA的过度增殖.由于线粒体DNA中各基因排列紧密利用率高，因而线粒体DNA任何部位的突变都会累及到基因中的一个重要功能区域，最终使氧化磷酸化功能受损.本实验结果显示，六味抗衰饮与衰老模型组比较，肝细胞mtDNA相对含量明显降低，提示六味抗衰饮具有保护肝细胞mtDNA的作用.

　　SOD是体内清除自由基的重要抗氧化酶，可以保护细胞免受损伤，随着年龄的增长，体内SOD活性逐渐降低，故SOD活力的高低与衰老密切相关［6-7］. MDA是机体脂质过氧化作用产生的脂质过氧化物，它可能引起细胞代谢及功能障碍甚至死亡，其含量与细胞损伤的程度呈正相关，可间接反映出机体受自由基攻击的严重程度. 六味抗衰饮与衰老模型组比较，血清SOD活性升高，血清MDA含量降低，说明六味抗衰饮具有较好地清除氧自由基，减少脂质过氧化物的产生，对细胞代谢及功能具有保护作用.

　　根据“衰老的线粒体学说”， 线粒体是自由基浓度最高的细胞，衰老机体清除氧自由基的能力下降，使线粒体ROS和自由基生成增加，导致体细胞mtDNA不断突变，由此引起线粒体膜结构和功能损伤，线粒体的损伤又不可避免地增强呼吸链的ROS和自由基的生成，如此反复恶性循环，最终引起组织和器官功能的衰退［8］. 由此可推测，六味抗衰饮保护肝细胞mtDNA的作用与其提高衰老状态下内源性抗氧化酶活性、清除体内氧自由基的作用密切相关.

　　中医学对衰老原因的认识较有代表性的有肾虚说、脾肾两虚说、血瘀说等. 近年来的研究表明，衰老是多因素综合作用的结果，脏腑虚衰是衰老的主要原因，痰浊、积滞、瘀血是导致衰老的重要因素［9-10］，二者互为因果不断恶性循环，加速衰老. 六味抗衰饮具有补气益精、理气活血、降脂通便的功效，其中，人参大补元气、安神益智，枸杞子滋补肝肾之精，三七花清热解毒降脂，决明子清肝降脂、利水通便，绞股蓝益肾安神、降脂通便，玫瑰花理气解郁、活血散瘀，全方补而不滞，通而不泻，药效平和，可泡服代茶饮，服用方便，具有较好的临床适用性.实验结果表明，六味抗衰饮能够通过减轻机体氧化损伤，保护肝细胞mtDNA，发挥延缓机体衰老的作用.

【】
  　　［1］ 徐智,吴国明,钱桂生,等. 大鼠衰老模型的初步建立［J］. 第三军医大学学报,2003,25(4):312.

　　［2］ 闫华超,贾少波,许恒龙,等. 动物线粒体DNA提取简易流程及其优化［J］. 生物技术通讯, 2007,18(1):95-97.

　　［3］ 陈作舟. 筛选机制与衰老的DNA损伤假说［J］. 激光生物学报, 2001,10(2):80-86.

　　［4］ 王月华,杜冠华. L?肉毒碱对D?半乳糖衰老模型小鼠的作用［J］. 老年学杂志, 2003,23(1):49-51.

　　［5］ 吴小晶,吴丽娟,李晓东,等. 线粒体DNA定量分析与衰老关系初探［J］. 中国老年学杂志,1999,19(5):315-317.

　　［6］ 陈瑾,李荣亨. 衰老的自由基机制［J］. 中国老年学杂志, 2004,24(7):677-679.

　　［7］ 海春旭. 抗氧化剂、抗衰老与疾病控制的研究进展［J］. 疾病控制杂志, 2002,6(4):289-293.

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　　［9］ 周丽珍,赵凤志,戴欣,等. 通补延衰方对衰老模型影响的形态学观察［J］. 中国老年学杂志,2000,1(20):35.