中西药结合对胃癌多药耐药的逆转和诱导凋亡作用

【摘要】  目的： 探讨中西药结合对人胃癌多药耐药细胞SGC?7901/ADR的逆转和诱导凋亡作用. 方法： 以斑贞1号和/或氟尿嘧啶（5?FU）为阳性对照组,采用MTT法观察斑贞1号与5?FU,川芎嗪（TMP）联合对SGC?7901/ADR细胞的逆转及杀伤作用. 采用流式细胞仪（FCM）测定各药物组细胞周期的变化. 光镜和电镜观察药物联合前后SGC?7901/ADR细胞形态结构变化. 结果： TMP明显提高SGC?7901/ADR细胞对斑贞1号+5?FU的敏感性,逆转倍数为10.39倍. 细胞毒作用为:斑贞1号+5?FU+TMP>斑贞1号+5?FU>斑贞1号>5?FU（P<0.01）. FCM分析证明3种药物联合与对照组相比可将细胞阻滞在DNA合成前期和静息期?G0/G1期（P<0.05）. 光镜和电镜下观察到癌细胞体积变小,胞体全面变圆皱缩及典型的凋亡形态学改变. 结论： 中西药结合对SGC?7901/ADR细胞有较强的逆转和诱导凋亡作用,为当前肿瘤提供了新思路.

【关键词】  中西医结合疗法 胃肿瘤 肿瘤细胞 多药耐药性 逆转 调亡

　　0引言

　　化疗在胃癌综合治疗中发挥着重要作用,但疗效差,主要是细胞对化疗药物产生了多药耐药性（multidrug resistance,MDR）［1-2］. 解决MDR主要方法,一是寻找对MDR细胞有效的抗肿瘤药物,二是通过增加细胞内药物浓度而逆转MDR. 但多数逆转剂的毒副作用限制了它们的临床应用. 中西医结合治疗肿瘤较中医或西医单独应用疗效佳,但对多药耐药肿瘤细胞是否有逆转作用,报道甚少. 我们观察中西药结合（斑贞1号+5?FU+TMP）对SGC?7901/ADR细胞MDR的逆转及诱导凋亡作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料人胃癌多药耐药细胞株SGC?7901/ADR细胞由第四军医大学西京消化研究所惠赠. TMP注射液,北京永康药业有限公司产品. 5?FU注射液,南通精华制药有限公司产品. 阿霉素（ADM）注射液,汕头特区明治医药有限公司产品. 斑贞1号合剂（斑蝥0.06 g,露蜂房12 g,山茱萸,女贞子各15 g）,内蒙古包头医学院第一附属医院中医科制备,含原药200 g/L. RPMI1640,美国Gibco公司产品. MTT,DMSO,胰蛋白酶,美国Sigma公司产品. 新生小牛血清,杭州四季青生物研究所产品. 流式细胞仪试剂盒,Exalpa公司产品. 倒置显微镜,重庆光学仪器厂产品. 酶标仪,美国Biotek公司产品. 流式细胞仪,美国BD公司产品. Hitachi750透射电镜,日本日立公司产品.

　　1.2方法将SGC?7901/ADR细胞置于含1.0 mg/L ADM,100 mL/L新生小牛血清,100 kU/L青霉素,100 mg/L 链霉素的RPMI1640细胞培养液中,37℃,50 mL/L CO2饱和湿度孵箱内培养. 实验两周前培养于不含ADM的细胞培养液中. 取对数生长期的SGC?7901/ADR细胞,以5×107/L接种于96孔板上,培养24 h,实验孔按下列分组加入药物：(1)空白对照组,(2)阴性对照组,(3)5?FU组（10～105μg/L）,(4)斑贞1号组（10～105μg/L）,(5)斑贞1号（10～105μg/L）＋5?FU（10～105μg/L）组,(6)斑贞1号（10～105μg/L）＋5?FU（10～105μg/L）＋TMP(终浓度300 mg/L)（参照临床用量的血峰浓度设定实验药物浓度）. 各浓度设5个平行孔,培养48 h,加入5 g/L MTT 20 μL,作用4 h后加入DMSO150 μL,摇床摇匀,以酶联免疫仪490 nm波长测定各孔吸光度A值［3］. 光镜下动态观察并拍照. 不同浓度下细胞的存活率SR［4］［SR=(实验组A值/对照组A值)×100%］、半数抑制浓度IC50及逆转倍数RI(RI=单独用药IC50/联合逆转剂后IC50).

　　1.2.1细胞周期的分析收集经过不同浓度药物处理的SGC?7901/ADR细胞,PBS洗涤后,700 mL/L冷乙醇固定过夜,离心去乙醇,加入10 mg/L RNA酶溶液及碘化丙啶（PI）染液，黑暗避光37℃水浴20 min,经特制的尼纶网滤器过滤（冰上操作）于检测管内,上流式细胞仪检测DNA含量和细胞周期,资料用Cellquest软件进行分析.

　　1.2.2细胞形态变化将SGC?7901/ADR细胞以5×107/L传代4瓶,2瓶对照,2瓶用药. 孵育24 h后,用药组加入斑贞1号（终浓度0.5 mg/L）+5?FU（终浓度0.5 mg/L）+TMP（终浓度300 mg/L）共4 mL,对照组更换培养液4 mL. 培养48 h后收集胰酶消化脱壁细胞,25 g/L戊二醛预固定,继用20 g/L俄酸固定,经梯度酒精脱水后用EPON812包埋,制作超薄切片（600 A）,染色按常规处理,经醋酸钠和柠檬酸铝双染后,电镜观察超微结构并拍照.

　　统计学处理: 计量数据用x±s表示,采用SPSS11.5统计软件包进行单因素方差分析及LSD?t检验,P<0.05为有统计学意义.

　　2结果

　　2.1SGC?7901/ADR细胞的逆转和细胞毒作用300 mg/L TMP与斑贞1号和5?FU联合可增强SGC?7901/ADR细胞对斑贞1号+5?FU的敏感性,逆转倍数为10.39倍,使其杀瘤效果增强. 对细胞的细胞毒作用依次为:斑贞1号+5?FU+TMP>斑贞1号+5?FU>斑贞1号>5?FU（P<0.01,表1）. 光镜下可见中西医结合组癌细胞体积变小，胞体全面变圆皱缩，细胞生长明显受到抑制（图1）.

　　表1中西药联合对SGC?7901/ADR细胞的细胞毒作用（略）
　　
　　bP<0.01 vs 5?FU组和斑贞1号+5?FU组.

　　A: 阴性对照组; B: 斑贞1号+5?Fu+TMP组.

　　图1SGC?7901/ADR细胞形态倒置显微镜 ×400（略）

　　2.2细胞周期分析中西药结合组可使SGC?7901/ADR细胞周期明显阻滞在DNA合成前期和静息期?G0/G1期,进入S期细胞减少,抑制细胞DNA的合成和有丝分裂（P<0.05）,诱导其凋亡（表2）.

　　2.3细胞超微结构的变化对照组癌细胞呈圆形或卵圆形,核大而不规则,核质比例大,核内异染色质较细,均匀分于核膜内侧,核仁1~2个,清晰可见,细胞质较少(图2A). 用药组癌细胞发生皱缩,胞膜表面微绒毛和伪足消失. 核缩小,核质比例小,部分细胞呈现典型凋亡改变,核固缩成球形或新月形或呈波纹状或折缝样,核仁消失,胞质内质网扩张,线粒体肿胀,出现空炮变性,继之细胞出泡,小泡脱落,大量凋亡小体形成(图2B).

　　表2药物对肿瘤细胞周期分布的影响（略）

　　A: 对照组×4000； B: 用药组×5000.

　　图2SGC?7901/ADR细胞超微结构（略）

　　3讨论

　　MDR是指肿瘤细胞接触一种化疗药物并产生耐药性,同时对其他结构和作用机制不同的化疗药物具交叉耐药性［5］. 5?FU是主要胃癌化疗药物之一,本课题组先前已证实了SGC?7901/ADR细胞对5?FU具有耐药性,相对耐药性为97.49. 同时在寻找高效低毒的逆转剂研究中,也证实了TMP较维拉帕米（VP）有较强的逆转作用. 然而肿瘤细胞的MDR是由多种因素、多种机制共同作用的结果,涉及到多种转运蛋白的改变、解毒系统的激活、凋亡通路的改变、DNA修复系统的增强等,特别是多种转运蛋白共同转运一种抗癌药形成的耐药性是导致目前的逆转只能部分逆转肿瘤细胞耐药性的重要原因. 许多研究表明［6］,中西药有机结合使用,可互相取长补短,表现出明显的协同作用. 因此,有计划、合理地运用中西医结合治疗便成为逆转MDR,诱导癌细胞凋亡,提高疗效的重要措施.

　　传统中医认为胃癌病机要点为脏腑阴阳失调,痰浊瘀毒,积聚凝结,胃腑壅塞,属本虚标实之证,治疗多采用杀毒化瘤、补气养血之法. 斑贞1号具有扶正祛邪,抑癌抗癌的作用. 本课题结果表明,TMP可以明显提高SGC?7901/ADR细胞对斑贞1号和5?FU的敏感性,三种药物联合与对照组相比对SGC?7901/ADR细胞有较强的逆转和诱导细胞凋亡的作用,使胃癌耐药细胞出现了典型的凋亡形态学改变,使细胞阻滞在?G0/G1期. 其机制是否通过作用于肿瘤细胞胞质骨架微管和微丝结构,引起骨架异常,导致有丝分裂紊乱？或是影响多药耐药相关基因的表达及功能?调控凋亡相关基因表达诱导凋亡？这些问题值得进一步深入研究. 通过对斑贞1号联合5?FU及TMP对胃癌耐药细胞的多药耐药性的作用和机制的研究,将会为胃癌多药耐药的治疗提供可靠的依据.

【】
  　　［1］ Lopes EC, Scolnik M, Alvarez E, et al. Modulator activity of psc833 and cycloporin?A in cincristine and doxoubic in selected multidrug resistant murine leukemic cells［J］. LeuK Res,2001,25(1)：85-93.

　　［2］ Shiraki N, Okamura K, Tokunaga J, et al. Bromocriptine reverses P?glycoprotein?mediated multidrug resistance in tumor or cells［J］. Jpn J Cancer Res, 2002,93:209-215.

　　［3］ 司徒镇强,吴军正. 细胞培养［M］. 北京：世界图书出版社, 2000：186-187.

　　［4］ Britton RA, Green JA, Warenius HM. Cellular glutathione(GSH) and glutathione S?transferase (GST) activity in human ovarian tumor biopsies following exposure to alkylating agents［J］. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1992,24(3):527-531.

　　［5］ Baldini N.Multidrug resistance:a multiplex phenomenon［J］. Nat Med,1997,3(4):378-380.

　　［6］ 布立民,韩英. 逆转胃肠道肿瘤多药耐药的研究进展［J］. 实用癌症杂志,2002,18(1):105-107.