维持性血透患者血清体外诱导血管新生

【摘要】  目的： 探讨维持性血液透析患者血清在体外诱导血管新生及其机制. 方法： 人脐静脉内皮细胞分别培养于100 mL/L透析患者血清培养基（实验组）和100 mL/L健康人血清培养基（对照组）. 倒置显微镜下观察血管样结构形成，MTT法检测细胞增殖，Transwell小室测定细胞迁徙能力，比色法检测细胞内活性氧（ROS）产生，Western Blot法检测p?p38蛋白表达. 结果： 实验组细胞培养30 h平均血管样结构形成面积（1438±240） μm2，MTT平均吸光度值1.073±0.046, 细胞小室平均迁移细胞数63.5±6.2，均高于对照组. 实验组细胞培养10 h p?p38表达及30 h细胞内活性氧产生均明显增加. 结论： 维持性血透患者血清能够在体外诱导血管新生，p?p38, ROS表达增加可能是这种作用的细胞内机制.

【关键词】  血管生成 血管内皮细胞 血液透析 p38 活性氧

　　0引言

　　近年来研究证实，无论何种病因，人类多种急慢性肾损害均伴有微血管系统丧失或过度新生，并且提出了调控血管新生改善肾病进展的概念. 在透析患者中，血管新生也有相关报道. Sakkas等［1］对12例血液透析患者的腓肠肌进行病理活检发现血管密度与肌纤维组织的比例增加，Serradell等报道血液透析患者血管病变早期有内皮细胞的增生，并且可能是血管早期病变的主要形式［2］. 血管新生是血管系统一种重要的代偿性变化，可能与血液透析患者血管系统并发症相关. 但血液透析患者血管新生机制尚不清楚，本文在体外细胞培养的水平研究维持性血液透析患者血清能否诱导血管新生，并且对其形成机制进行初步探讨.

　　1对象和方法

　　1.1对象选取1996?09/2006?10我院11例维持性血液透析患者及10例健康志愿者，所有对象均签署知情同意书. 血液透析患者平均年龄（63.2±4.4）岁，原发病为慢性肾炎、高血压肾病和多囊肾等. 所有患者均用碳酸盐透析，每周透析3次，每次4.5 h. 采用聚砜膜F7型透析器. 健康对照组平均年龄（58.3±5.1）岁，均为建康志愿者. 两组的年龄、性别组成无统计学差别. 透析患者在透析后2 h动脉端采血，正常对照组清晨空腹采血，取血后立即低温离心（4 000 r/min，20 min），取上层血清-70℃保存备用.

　　1.2方法

　　1.2.1内皮细胞培养及实验分组人脐静脉内皮细胞（HUVEC）由重庆医科大学组胚教研室惠赠，内皮细胞常规培养于含100 mL/L胎牛血清（杭州四季青）的RPMI 1640培养基（Gibco），置于37℃ 50 mL/L CO2培养箱中孵育. 细胞分为实验组和对照组，实验组用含100 mL/L透析患者血清的RPMI 1640培养基，对照组用含100 mL/L健康人血清的RPMI 1640培养基.

　　1.2.2血管样结构形成实验把HUVECs接种于24孔培养板，经上述干预10,20,30 h，200倍光学显微镜下每孔随机选择10个视野计数形成血管样结构的数目及面积（ImagePro?Plus 5.1图像分析软件），结果取均值.

　　1.2.3四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法检测细胞增殖HUVECs分别在实验组和对照组培养基中以2×106/L密度接种于96孔培养板，每孔总体积200 μL，置于37℃ 50 mL/L CO2培养箱中孵育，分别在10,20,30 h后，每孔加入MTT（Sigma）溶液（5 g/L）20 μL，继续孵育4 h，弃上清，每孔加入二甲亚砜（Sigma）150 μL，室温震荡10 min，在波长570 nm处用酶标仪测量吸光度A值. 每组、每个检测点设6个复孔，重复2次，结果取均值.

　　1.2.4Transwell小室检测细胞迁徙能力Transwell小室（Costar）滤膜上先铺以含250 mL/L基质胶的RPMI 1640培养基，HUVECs分别在实验组和对照组培养基中以5×108/L密度种于小室内，总体积0.4 mL，再把小室放入24孔培养板孔内，每孔再加入相同培养基0.6 mL，培养30 h后用40 g/L多聚甲醛固定细胞，擦净滤膜内表面细胞，HE染色，400倍光学显微镜下随机选择10个视野，计数每个视野细胞数目，结果取均值. 以迁移细胞数目表示细胞的迁徙能力.

　　1.2.5比色法检测细胞内活性氧把HUVECs以2×107/L密度接种于48孔培养板，经前述培养及分组干预10,30 h后，弃上清，每孔加入200 μL蒸馏水，冰上吹打直至细胞溶解. 每孔的200 μL细胞裂解液按活性氧测定试剂盒（南京凯基生物）说明书检测. 最后各孔细胞产生活性氧能力. 每组、每个检测点设6个复孔，实验重复2次，结果取均值.

　　1.2.6Western Blot法检测细胞p?p38表达把HUVEC接种于50 mL培养瓶，经前述培养及分组干预10 h后用PBS洗2次，加入细胞裂解液冰上吹打30 min，然后4℃ 12000 g离心30 min，取上清用BAC法进行蛋白定量. 制备100 g/L SDS?PAGE凝胶，蛋白加样量40 μL，100 V电压电泳2 h分离蛋白，然后用电印迹系统（20 mA，15 h）把蛋白转到PVDF膜上. 转有蛋白的膜先用血清37℃封闭1 h，然后用p?p38 1∶300稀释的一抗（Santa Cruz） 37℃孵育2 h，再用1∶1000稀释的相应二抗37℃孵育1 h，最后用化学发光试剂显示目的条带，在美国Rio?Rad图像分析系统中爆光成像.

　　统计学处理:实验数据以x±s表示，统计学分析采用重复方差分析中的方差分量模型（type=VC）方法. 全部数据采用SAS 9.1统计软件进行数据处理. P<0.05认为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1血管样结构形成实验细胞培养10,20 h两组无明显血管样结构形成. 30 h后，实验组有双层细胞形成，部分融合层细胞迁移到上面，变为长梭形，迅速生长，并形成血管样结构；对照组无血管样结构形成. 实验组200倍光学显微镜下平均每个视野可见8.3±2.5个血管样结构,平均每个视野血管样结构面积（1438±240 ） μm2（图1）.

　　A： 对照组细胞向双层生长但无血管样结构形成; B： 实验组细胞也双层生长，上层有血管样结构形成.

　　图1血清培养基培养30 h后HUVEC血管样结构形成×200（略）

　　2.2四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法检测细胞增殖从10 h到30 h对照组与实验组A值都升高，表明两组细胞都在增殖（P<0.001）. 在10 h两组差异无显著性（P=0.1586），20,30 h实验组A值高于对照组，具有统计学差异（P<0.001,表1）.

　　表1MTT法不同时间两组细胞570 nm处A值（略）

　　bP<0.01 vs 对照； cP<0.01 vs 20 h； dP<0.01 vs 10 h.

　　2.3Transwell小室检测细胞迁徙能力细胞培养30 h后对照组迁移过滤膜的细胞为400倍光学显微镜下平均每视野14.9±2.8个，实验组平均迁移过滤膜的细胞为63.7±4.5个，与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05，图2).

　　A： 对照组迁移过来的细胞较少; B： 实验组迁移过来的细胞较多.

　　图2血清培养基培养30 h后HUVEC迁徙能力×400（略）

　　2.4比色法检测细胞内活性氧细胞分别培养10,30 h后对照组在2个检测点，产生活性氧差别无统计学意义［(9.8±7.7) kU/L vs (10.1±8.0) kU/L,P=0.904］，实验组在2个检测点产生活性氧逐渐增多，差异具有统计学意义［(14.1±7.3) kU/L vs (25.0±7.7) kU/L, P=0.011），并且在30 h实验组比对照组产生更多活性氧，具有统计学差异（P=0.001）.

　　2.5Western Blot法检测细胞p?p38表达细胞培养10 h后，实验组p?p38表达比对照组增多（图3）.

　　A: 10 h; B: 30 h.

　　图3血清培养基培养10 h后HUVEC p?p38蛋白表达（略）

　　3讨论

　　长期血液透析患者由于透析膜不相容性导致的补体激活和白细胞活化，使透析患者血中氧自由基产生增加，氧自由基可通过NF?ΚB信号途径促使巨噬细胞和血管平滑肌细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）［3］. Awlak等［4］报道，血液透析患者血中VEGF高水平与氧化应激相关，升高程度受肾功能、年龄和透析年限等因素影响. 另外，长期血液透析患者都有不同程度贫血，贫血可使机体内处于一种长期低氧血症，而局部组织氧浓度下降可以调节VEGF的产生并且低氧血症可以上调VEGF受体的表达［1］. VEGF及其受体是调节血管新生和血管通透性最重要的细胞因子［5］. 另一种重要的促血管形成因子是血小板源生长因子（PDGF），血液透析中血小板与透析膜接触可以诱发血小板α颗粒内容物释放，其主要成份为PDGF. Cianciolo等［6］临床研究也表明，血液透析中患者PDGF水平升高，并且透析结束后回降缓慢. 所以血液透析患者血中，有促血管新生的因素增加. 在本实验中发现，与正常人血清比较，透析患者血清可以促进HUVEC增殖，使其迁徙能力增强；并且可以有血管样结构形成，说明透析患者血清可以有促血管新生作用.

　　血管内皮细胞内产生的ROS引起人们的重视，作为细胞内第二信使其具有复杂多样的作用，包括血管新生［7-8］. VEGF促血管新生可以通过NADPH氧化酶?ROS途径完成［9］. 在本实验中，在血管样结构形成之前，两组细胞内ROS产生无显著差异，而在30 h有血管样结构形成时，实验组细胞内ROS产生多于对照组. 透析患者血清可以诱导血管新生，并且细胞内ROS产生增多，说明ROS在血管形成中发挥作用. Ikeda等［10］研究证明，VEGF可以通过GDP结合蛋白Rac1激活NADPH氧化酶，使细胞内ROS产生增加，促进HUVEC的迁徙与增殖. 因此，在透析患者血清诱导血管新生中，ROS可能是促进细胞迁徙与增殖的重要细胞内物质. 在本实验中，p38与ROS共同作用促血管新生.

【】
  　　［1］ Sakkas GK, Ball D, Sargeant AJ, et al. Skeletal muscle morphology and capillarization of renal failure patients receiving different dialysis therapies［J］. Clin Sci，2004，107(6):617-623.

　　［2］ Serradell M, Diaz?Ricart M, Cases A, et al. Uraemic medium accelerates proliferation but does not induce apoptosis of endothelial cells in culture［J］. Nephrol Dial Transplant，2003，18(6):1079-1085.

　　［3］ Pawlak K, Pawlak D, Mysliwiec M. Impaired renal function and duration of dialysis therapy are associated with oxidative stress and proatherogenic cytokine levels in patients with end?stage renal disease［J］. Clin Biochem, 2007，40(1-2):81-85.

　　［4］ Awlak K, Pawlak D, Mysliwiec M. Possible association between circulating vascular endothelial growth factor and oxidative stress markers in hemodialysis patients［J］. Med Sci Monit, 2006，12(4):CR181-185.

　　［5］ 凌瑞，孙宝华，王廷，等. VEGF b?FGF诱导人脐血单个核细胞向血管内皮祖细胞分化的研究［J］. 第四军医大学学报，2007, 28（2）：137-139.

　　［6］ Cianciolo G, Stefoni S, Donati G, et al. Intra?and post?dialytic platelet activation and PDGF?AB release: cellulose diacetate vs polysulfone membranes［J］. Nephrol Dial Transplant，2001，16(6):1222-1229.

　　［7］ Wu G, Luo J, Rana JS, et al. Involvement of COX?2 in VEGF?induced angiogenesis via P38 and JNK pathways in vascular endothelial cells［J］. Cardiovasc Res，2006，69(2):512-519.

　　［8］ 张严高，秦永文，吴弘，等. MAPK在葡萄糖及AngⅡ致血管平滑肌细胞增殖反应中的作用［J］. 第四军医大学学报，2006, 27（22）：2026-2028.

　　［9］ Ushio?Fukai M. VEGF signaling through NADPH oxidase?derived ROS［J］. Antioxid Redox Signal，2007，9(6):731-739.

　　［10］ Ikeda S, Ushio?Fukai M, Zuo L， et al. Novel role of ARF6 in vascular endothelial growth factor?induced signaling and angiogenesis［J］. Circ Res，2005，96(4):467-475.