OX?42和Fos蛋白在海人酸致癫大鼠前脑中早期的表达变化
【摘要】 目的： 研究大鼠在海人酸(KA)导致癫痫发作早期前脑内小胶质细胞的变化及其与神经元的关系. 方法： 应用免疫组织化学法单标分别显示前脑内OX?42和Fos蛋白表达的时间，并用免疫组织化学双重标记显示OX?42和Fos阳性细胞的相互关系. 结果： 在KA致大鼠癫痫发作早期（从15 min到360 min），前脑的小胶质细胞OX?42表达阳性，随着存活时间的变化，OX?42的阳性反应经历逐渐升高又降低的过程；反应强弱： 120 min组>360 min组>60 min组>30 min组>15 min组. Fos蛋白在神经元和小胶质细胞中均表达阳性，也呈现逐渐升高又降低的变化,但Fos阳性小胶质细胞出现高峰的时间早于Fos阳性神经元,各组间Fos阳性神经元数量差异均有统计学意义（P<0.01）. OX?42阳性小胶质细胞和Fos阳性神经元在前脑主要分布于大脑皮层、海马、杏仁核等部位，两者的分布特征基本一致. 结论： 小胶质细胞可能和神经元一起参与了KA所致癫痫发作早期的变化.
【关键词】 小神经胶质细胞 神经元 OX?42 Fos 癫痫 大鼠
0引言
癫痫是一组慢性脑病综合征，其发病与神经?免疫?内分泌的调节失衡有关［1］. 既往有关癫痫的研究多围绕神经元和星形胶质细胞展开［2］，而对小胶质细胞的相关研究以及有关癫痫发作后短时间内小胶质细胞有无变化的研究尚少见报道. 本实验观察了小胶质细胞在癫痫发作后短时间内的变化，以探讨癫痫发作早期小胶质细胞的活化及其与神经元的关系和小胶质细胞在癫痫发作时可能的作用.
1材料和方法
1.1材料SD成年雄性大鼠35只，体质量200~250 g（第四军医大学实验动物中心提供），将动物置于20℃、安静的环境中饲养48 h. 小鼠抗OX?42抗体（产品编号：CBL1512P），兔抗Fos抗体（产品编号：MAB1283）（美国Santa Cruz公司）；生物素标记山羊抗小鼠IgG（产品编号：C0252），生物素标记的山羊抗兔IgG（产品编号：C0252），生物素?卵白素?HRP复合物（ABC，产品编号：C1785）（美国Sigma公司）；BX?60型显微镜（日本奥林巴斯公司）；DF?300图像采集数码摄像头（德国莱卡公司）.
1.2方法
1.2.1实验分组将大鼠随机分为对照组（n=5）和癫痫发作后15，30，60，120，360 min 5个实验组（n=6）.
1.2.2组织材料的处理大鼠按体质量6 mg/kg腹腔注射5 g/L的海人酸（kanic acid，KA）并观察其行为变化，凡出现凝视、湿狗样抖动、节奏性咀嚼、点头、肢体阵挛、阵发性旋转、跌倒等癫痫发作的表现，即为模型制作成功. 各实验组用过量10 g/L戊巴比妥钠（>40 mg/kg，i.p.）麻醉，迅速开胸经左心室至升主动脉插管，先以100 mL生理盐水洗去血液，随后用4℃含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PB, pH7.4）先快后慢灌流固定2 h，然后取脑置于300 g/L的蔗糖中（4℃）直至组织沉底. 冰冻切片机切制连续冠状切片，片厚30 μm，切片分为三套，置于0.01 mol/L PBS中存放.
1.2.3免疫组织化学标记
1.2.3.1免疫组织化学单重标记取2套切片在0.01 mol/L PBS中漂洗后，入含3 g/L Triton X?100的0.01 mol/L PBS中浸泡30 min，然后依次进行：①小鼠抗OX?42抗体稀释液（1∶3000）或兔抗Fos抗体稀释液（1∶3000）孵育24 h；②生物素标记的山羊抗小鼠IgG（1∶500）或生物素标记的山羊抗兔IgG（1∶500）孵育2~4 h；③生物素?卵白素?HRP复合物（ABC，1∶500）浸泡2~4 h. 然后用葡萄糖氧化酶?DAB?硫酸镍铵法染色，OX?42和Fos产物均呈蓝色，OX?42以小胶质细胞胞质出现蓝色颗粒判定为阳性，Fos以神经元和小胶质细胞的细胞核出现蓝色颗粒判定为阳性. 以上每一步骤之后均用0.01 mol/L PBS液充分漂洗3次，每次10 min. 显色后切片经漂洗后裱片、晾干、脱水、透明，封固后显微镜观察并采集图像.
1.2.3.2免疫组织化学双重标记另取1套切片单重标记抗Fos显色后，再进行抗OX?42的第二重染色. ①小鼠抗OX?42抗体稀释液（1∶3000）室温孵育24 h；②生物素标记的山羊抗小鼠IgG（1∶500）室温孵育2~4 h；③生物素?卵白素?HRP复合物（ABC，1∶500）室温浸泡2~4 h. DAB?H2O2溶液中进行棕色反应，OX?42阳性产物呈棕色结果判定为阳性. 结束两次染色的切片经漂洗后裱片、晾干、脱水、透明，封固后在光镜下观察并采集图象. OX?42阳性反应强弱，+/-：表示弱阳性或无反应；+：表示弱阳性；?：表示阳性；?：表示强阳性；?：表示极强阳性.
1.2.4对照实验及替代实验对照组大鼠腹腔注射生理盐水1.5 mL，分别于15，30，60，120，360 min后灌流固定、取材并进行免疫组织化学检测；取实验组切片，用0.01 mol/L PBS替代抗OX?42和抗Fos抗体稀释液，按ABC法进行免疫组化染色.
统计学处理：采用SPSS13.0统计软件进行分析，对FOS阳性神经元进行计数，数据以x±s表示，所用统计分析方法为方差分析，组间多重比较采用LSD?t检验.
2结果
2.1动物一般行为改变各实验组大鼠给药后均出现凝视、湿狗样抖动、节奏性咀嚼、点头、肢体阵挛、阵发性旋转、跌倒等癫痫发作表现，而对照组行为正常，无任何癫痫发作表现.
2.2OX?42阳性细胞在前脑分布及表达的时间
2.2.1OX?42阳性细胞在前脑分布的区域对照组大鼠在前脑内可见有少量OX?42阳性细胞散在分布，阳性细胞的胞体小，突起多而细，呈静息型；KA导致癫痫发作后OX?42阳性细胞数量明显增加，细胞由静息型转变为激活型，其特点是OX?42染色深，胞体变大，突起变长粗，在前脑主要集中分布在大脑皮层（包括扣带回、额叶、顶叶和颞叶）（图1A），在海马各亚区主要分布在分子层和多形层（包括CA1，CA2，CA3，CA4和齿状回），锥体细胞层和颗粒细胞层阳性细胞很少（图1B）和杏仁核簇（图1C），OX?42阳性细胞的分布没有明显变化.
A: OX?42在大脑皮层的分布×240； B: OX?42在海马CA3区的分布×120； C: OX?42在杏仁核的分布×120.
图1海人酸致癫发作120 min后OX?42阳性细胞的分布（葡萄糖?ＤＡＢ?硫酸镍铵法）（略）
2.2.2OX?42阳性表达的时间规律结果显示，癫痫发作后15 min组可以见到少量OX?42阳性细胞，阳性细胞的胞体小，突起多而细，呈静息型；30 min组阳性细胞数量较10 min组增多；60 min组阳性细胞数量较30 min组增多，胞体增大，突起变短，向激活型转变；120 min组阳性细胞数量进一步增多，细胞体积更大，突起少而粗大，阳性细胞无论在数量还是在体积上均达到高峰，细胞呈激活型；至360 min时，阳性细胞数量及形态与120 min组相似，仍为激活型.
2.3Fos阳性神经元在前脑分布及表达的时间规律
2.3.1Fos阳性神经元在前脑分布的区域用硫酸镍铵加强的免疫组织化学显色结果为蓝黑色，Fos免疫阳性物质位于细胞胞核内，神经元、星形胶质细胞及小胶质细胞均可能表达Fos蛋白. 因小胶质细胞的胞核很小，在未与OX?42双重标记的单标切片中难于辨认，且与星形胶质细胞表达的Fos阳性胞核无法区别. 对照组大鼠在前脑内未见Fos阳性细胞；KA导致癫痫发作后Fos阳性细胞数量明显增加，在前脑主要集中分布在大脑皮层（包括扣带回、额叶、顶叶和颞叶）（图2A）、海马和杏仁核簇（图2B）.
A:Fos蛋白在大脑皮层的分布×24； B：Fos蛋白在杏仁核的分布×60.
图2海人酸致癫发作120 min后Fos阳性神经元的分布（葡萄糖?ＤＡＢ?硫酸镍铵法）（略）
2.3.2Fos阳性神经元表达的时间规律 观察结果显示，癫痫发作后15 min组未见Fos阳性细胞；30 min组阳性细胞开始出现；60 min组阳性细胞数量较30 min组增多；120 min组阳性细胞数量进一步增多，阳性细胞数量达到高峰（图2）；至360 min时，阳性细胞数量明显下降. 对FOS阳性神经元进行计数，以每组共计6只大鼠12张切片24个60×视野所得. 反应强度的时间规律见表1.
表1大脑皮层内OX?42阳性小胶质细胞和FOS阳性神经元反应的时间规律（略）
P<0.01 vs 实验组各时间点
2.4OX?42阳性细胞和Fos阳性细胞的关系在OX?42和Fos双标的切片中可见3种染色类型：①Fos阳性的神经元胞核（Fos+细胞）和Fos阳性的胶质细胞胞核（可能是星形胶质细胞），由于神经元胞核与胶质细胞胞核在大小上的明显差别，使之容易区别；②Fos阴性而OX?42阳性的小胶质细胞（OX?42+细胞），其胞质和突起为棕色，胞核未染色；③蓝色Fos阳性胞核和棕色OX?42阳性的胞质双重标记的小胶质细胞（Fos+/ OX?42+细胞）. Fos+/ OX?42+细胞与Fos+细胞和OX?42+细胞在前脑的分布也很相似，主要位于大脑皮层（包括扣带回、额叶、顶叶和颞叶）、海马和杏仁核簇（图3）.
箭头所指为Fos+/OX?42+的小细胞（免疫组织化学双标染色法）.
图3海人酸致癫发作120 min后Fos和OX?42在大脑皮层的分布.（略）
3讨论
KA是天然提取的谷氨酸类似物，它可以与突触后KA受体结合，产生兴奋性突触后电流，引起神经元的过度兴奋. 全身或大脑局部注射KA可以导致动物癫痫发作，是理想的颞叶癫痫模型.
我们通过对小胶质细胞的形态和数量变化规律的观察发现KA引起癫痫发作后30 min海马静息小胶质细胞的数目就已经增多，随后很快转化成激活型小胶质细胞并且表达Fos蛋白，此时癫痫的发作还不会引起神经元死亡，只是导致神经元的过度兴奋. 这提示不仅神经元的死亡可以引起小胶质细胞的活化，而且神经元的过度兴奋也可以引起小胶质细胞的活化. 本实验中神经元过度兴奋引起小胶质细胞活化的过程相当迅速，只需30 min其数量就已经增多. Taylor等［2］在体外的实验证明谷氨酸可以作用于小胶质细胞上的代谢型谷氨酸受体，从而引起小胶质细胞的激活，KA引起癫痫发作时神经元释放的大量兴奋性神经递质谷氨酸也有可能引起小胶质细胞的活化. 在本实验中，我们也观察到激活的小胶质
细胞与Fos阳性神经元的分布基本一致，这在空间上提供了神经元释放谷氨酸引起小胶质细胞的活化的可能.
Fos蛋白作为即刻早期基因c?fos 的转录表达产物，广泛用于显示神经元的功能状态. 在本研究中，我们观察到神经元的Fos蛋白表达情况与报道的一致［3］. 我们在小胶质细胞中也观察到Fos蛋白的表达，说明在癫痫发作早期小胶质细胞被激活后也能表达Fos蛋白，从而启动基因的转录，这可能是它发挥作用的重要途径.
在神经元死亡后活化的小胶质细胞吞噬细胞碎片是众所周知的. 新近的报道中人们发现小胶质细胞活化后可以表达胶质细胞源性谷氨酸转运体，通过清除谷氨酸来保护受损的神经元［4-6］. 早期的小胶质细胞在神经元尚未发生死亡时的活化很可能具有修复过度兴奋的神经元的作用. 这有可能同时通过释放各种细胞因子，促进神经元的死亡，其作用机制还需要进一步的研究.
【文献】
［1］ Wolfgang JS, Jessica RC, Sarah EF, et al. Role of microglia Ⅰ the central nervous system?s immune respone［J］. Neurol Res, 2005, 27:685-691.
［2］ Taylor DL, Diemel LT, Pocock JM. Activation of Microglial Group III Metabotropic Glutamate Receptors Protects Neurons against Microglial Neurotoxicity［J］. J Neurosci, 2003, 23(6):2150-2160.
［3］ Shehab S, Coffey P, Dean P, et al. Regional expression of fos?like immunoreactivity following seizures induced by pentylenetetrazole and maximal electroshock［J］. Exp Neurol, 1992, 118(3):261-274.
［4］ Konsman JP, Kelley K,Dantzer R, et al.Temporal and spatial relationships between lipopolysaccharide?induced expression of Fos, interleukin?1beta and inducible nitric oxide synthase in rat brain［J］. Neuroscience,1999,89：535-548.
［5］ Matute C, Domercq M, Sánchez?Gómez MV. Glutamate?mediated glial injury: Mechanisms and clinical importance［J］. Glia.2006，53(2):212-224.
［6］ Beschorner R, Dietz K, Schauer N, et al. Expression of EAAT1 reflects a possible neuroprotective function of reactive astrocytes and activated microglia following human traumatic brain injury［J］. Histol Histopathol,2007,22(5):515-526.
