噬菌体随机12肽库中VEGF模拟表位的筛选及初步鉴定

【摘要】  目的： 从噬菌体随机12肽库中筛选能与抗血管内皮生长因子(VEGF）mAb阿瓦斯汀(Avastin)特异性结合的多肽. 方法： 用Avastin为靶分子，对噬菌体12肽库进行3轮生物淘洗，随机挑取80个克隆，ELISA法鉴定其亲和性，将亲和性高的阳性克隆进行DNA序列测定，推导与噬菌体外壳融合的12肽氨基酸序列. Fmoc固相法合成12肽，戊二醛交联12肽与血蓝蛋白（KLH），打点印迹（Dot blot）检测偶联物能否与Avastin 结合. 结果： ELISA显示，42个噬菌体克隆与Avastin有较强的亲和性，测序发现41个阳性克隆表达的融合12肽的序列一致，1个不同；化学合成的12肽能与Avastin特异性结合，12肽?KLH偶联物也能与Avastin特异性结合. 结论： 初步证明12肽模拟了VEGF部分表位.

【关键词】  Avastin(bevacizumab) 细菌噬菌体 肽库 血管内皮生长因子 交联

　0引言

　　血管生成是肿瘤生长和转移的前提［1］. 血管内皮生长因子(VEGF) 是促进血管形成过程中的关键因子［2-3］.肿瘤组织中VEGF表达水平与肿瘤血管化的程度、恶性程度呈正相关［4-5］. 因此，VEGF是肿瘤抗血管生成中比较理想的靶分子. 噬菌体随机肽库含有的大量不同序列结构多肽可作为任何靶抗原表位的模拟肽，运用肽库筛选时不需要靶蛋白的任何结构，只需靶抗原的mAb就可以获得具有免疫原性和抗原性的多肽，它们反映了抗原结合位点的特定的构像 ［6-7］. 我们利用抗VEGF mAb 阿瓦斯汀（Avastin）对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选，旨在筛选出能与Avastin有高亲和力的噬菌体克隆，并分析其展示的多肽序列能否模拟VEGF的表位.

　　1材料和方法

　　1.1材料抗VEGF mAb Avastin(罗氏公司)；噬菌体随机12肽库（新英格兰生物公司）；PEG8000（华美生物公司）；IPTG,X?Gal、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗噬菌体单克隆羊抗体(HRP?anti?M13，皮尔斯生物技术公司）；血蓝蛋白（KLH，西格玛公司）. 550型ELISA读数仪（美国伯乐公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1VEGF模拟表位肽的筛选

　　1.2.1.1噬菌体库的生物淘洗用100 g/L Avastin 150 μL包被96孔板的1个孔，4℃过夜，封闭后加入100 μL TBST稀释10 μL 12肽库，室温作用1 h，用1 ml/L TBST冲洗10次. 加入洗脱液(0.2 mol/L Glycine?HCl,1 g/L BSA)100 μL作用8 min，吸出洗脱液，再用1 mol/L Tris?HCl 15 μL中和上述洗脱液. 吸取1 μL洗脱液测定滴度，其余液体加入20 mL LB培养基（含ER2738 200 μL，四环素贮液20 μL）进行扩增和纯化. 按以上步骤进行第2,3轮筛选，但分别用3，5 mL/L TBST洗涤.

　　1.2.1.2阳性噬菌体的鉴定第3轮筛选完成后，挑选80个分割良好的噬菌体克隆分别进行扩增和纯化. 将纯化好的噬菌体分别加入预先包被了Avastin和人IL?15 mAb（阴性对照）的96孔板中，室温作用1 h；加入HRP标记的抗M13（1∶2000）抗体，作用1 h. OPD显色，测定A490 nm值，以A490 nm值高于阴性对照2.1倍作为阳性克隆.

　　1.2.1.3阳性噬菌体与Avastin结合的剂量依赖实验以5 mg/L Avastin包被96孔板,每孔100 μL，同时对每个Avastin包被孔设立IL?15 mAb的包被孔为阴性对照，4℃孵育过夜. 加入封闭液（5 mg/L BSA,0.1 mol/L NaHCO3, pH 8.6），4℃封闭2 h，将阳性噬菌体稀释至5×1014pfu/L后作倍比稀释（pfu：噬菌斑形成单位），直至其滴度为1.9×1010pfu/L ，分别加入Avastin及IL?15 mAb包被孔，100 μL/孔，室温孵育2 h，每孔加入HRP标记的小鼠抗M13噬菌体mAb（1∶5000）100 μL，室温孵育1 h，OPD显色后测定A490 nm值.

　　1.2.1.4阳性噬菌体单链DNA的提取及测序取500 μL上述噬菌体贮液，加入200 μL PEG8000/NaCl放置10 min，离心10 min，弃上清，沉淀重悬于100 μL碘化物缓冲液中，加入250 μL乙醇，室温作用100 min，离心100 min，弃上清，用700 mL/L乙醇洗沉淀，短暂真空干燥. 沉淀重悬于30 μL TE(0.01 mol/L Tris?HCl，1 mmol/L EDTA)中，取上述溶液5 μL送上海生工生物公司测序.

　　1.2.2人工合成12肽与Avastin结合的剂量依赖实验将不同稀释度的合成12肽加入对应的孔中（初始浓度为16 g/L，倍比稀释至终浓度为 0.25 g/L），每孔100 μL ,4℃过夜；封闭2 h，将Avastin和IL?15 mAb分别加入对应孔中,每孔100 μL，室温反应1 h；每孔加入小鼠抗人IgG抗体（1∶1000) 100 μL，室温反应1 h；每孔加入HRP标记的山羊抗小鼠抗体（1∶5000) 100 μL，温孵育1 h，OPD显色后测A490 nm值.

　　1.2.3人工合成12肽与KLH偶联［8］将10 mg KLH融于2 mL pH 10的硼酸盐缓冲液中，温和震荡，加入12肽15  mg，缓慢滴入3 mL/L戊二醛溶液1 mL，震荡2 h至溶液变为黄色，加入1 mol/L甘氨酸作用30 min. 将反应物在pH 8.5的硼酸盐缓冲液中4℃透析过夜，更换缓冲液继续透析4 h.

　　1.2.4偶联物的Dot blot鉴定［9］取12肽?KLH偶联物5 μL，缓慢点在NC膜上，待干透以后，以含2 g/L BSA的TBS（pH 7.3）封闭2 h. 5 mL/L TBST洗涤3次，每次5～10 min. 加入10 mg/L Avastin室温孵育2 h. TBST同法洗涤后，加入AP?羊抗人二抗，室温孵育1 h. 洗涤后显色，以不加戊二醛的反应体系产生的蛋白及无关12肽?KLH偶联物为对照.

　　1.2.5分光光度法偶联物的结合比取KLH溶液、12肽溶液、结合物溶液，分别测定其A280 nm值，根据朗伯?比尔定律计算3种溶液在280 nm处摩尔吸光系数ε. 由光的加合性原理可知ε结合物=ε12肽+εKLH ，结合物中KLH与12肽的结合比由以下公式计算：结合比= （ε结合物-εKLH）/ε12肽. 

　　2结果

　　2.1噬菌体库生物淘洗在3轮生物淘洗中，阳性噬菌体的得率逐渐增大(表1)，表明所淘选的噬菌体得到了选择性的富集.

　　表1亲和淘选对噬菌体的富集（略）

　　2.2阳性噬菌体克隆的鉴定ELISA结果显示80个噬菌体克隆中有42个噬菌体可以较好地与Avastin结合，而不与对照IL?15 mAb结合，确定这42个为阳性噬菌体克隆(图1).

　　图1阳性噬菌体克隆与抗体的结合力（略）

　　2.3阳性噬菌体特异性分析随着阳性噬菌体投入量的增大，A490 nm值也增大，表明噬菌体与Avastin的结合呈剂量依赖性，也表明阳性噬菌体与Avastin的结合为特异性（图2）. 

　　2.4阳性噬菌体克隆测序对42个阳性噬菌体克隆进行DNA序列测定，根据所测得的DNA序列推导其所编码的融合12肽氨基酸序列，发现41个阳性克隆所展示的12肽具有同样的序列,一个噬菌体展示的序列不同.

　　图2阳性噬菌体与Avastin结合的剂量依赖试验 （略）

　　2.5人工合成12肽与Avastin结合的剂量依赖性化学合成的12肽可与Avastin特异性结合，该结合呈剂量依赖性(图3).

　　图3人工12肽与Avastin结合呈剂量依赖关系（略）

　　2.6偶联物Dot blot 结果及结合比12肽?KLH偶联物与Avastin可特异性结合（图4），偶联物中12肽与KLH的结合比为520.

　　1：12肽?KLH偶联物； 2：KLH； 3：无关对照12肽?KLH偶联物.
　　
　　图412肽?KLH偶联物与Avastin结合的Dot blot 鉴定（略）

　　3讨论

　　Avastin是针对VEGF的第一个上市的单克隆抗体，它具有良好的抗肿瘤及抗血管生成效果［10-12］，然而Avastin又存在价格昂贵、不良反应较多等缺点，从而限制了其应用，如果能找到VEGF的表位，并以此构建针对VEGF的自体疫苗，便可避免mAb的诸多缺点. 噬菌体展示技术，多肽人工合成技术和蛋白质化学偶联技术为构建这种疫苗提供了平台，已有研究者应用这些技术成功构建了自体疫苗，如Angelika使用Cetuximab筛选了EGFR的模拟表位，构建了针对EGFR的自体疫苗［13］.

　　按照以上思路构建的VEGF模拟多肽制备疫苗，与传统的直接用重组的人VEGF作为抗原刺激机体相比具有以下优点：制备简单，价格低廉；避免了VEGF潜在的引起肿瘤的作用；性质稳定，无内毒素和感染源等.

　　我们用Avastin对噬菌体随机12肽库进行了3轮生物淘洗，在特异性噬菌体得到富集后，随机挑选80个噬菌体克隆，确证其中42个噬菌体克隆与Avastin具有较高的亲和性，然后提取噬菌体DNA后进行序列分析，发现有41个噬菌体表达的融合12肽序列完全一致，这一结果提示该12肽模拟了VEGF的表位. 但同时发现这41个噬菌体与Avastin的结合力却有差异，分析原因是噬菌体在扩增后滴度不同，导致等体积噬菌体悬液与Avastin的结合力不同. 我们将在下一步试验中优化扩增噬菌体的条件，使扩增后的噬菌体滴度一致，从而减少这种差异.

　　在本实验中，我们直接合成了筛选的12肽，但由于合成的12肽所处的环境与表达在噬菌体表面时不同，所以阳性噬菌体虽然能与Avastin结合，而我们仍然要验证合成的12肽能否与Avastin结合，结合试验表明合成的12肽能够与Avastin结合，且结合呈剂量依赖性， 12肽脱离噬菌体后性质不变.

　　12肽是小分子物质，分子量只有1700 ku，抗原性很弱，不能直接诱导机体产生体液免疫反应，因此必须将12肽与分子量大的载体蛋白连接，使之具备抗原性. 载体和连接方法的选择我们采取了以下原则［14］：①12肽的氨基酸组成；②连接过程不能影响12肽的结构特异性；③连接反应的效率高、产物均一、易于纯化；④连接后载体蛋白不能对12肽产生空间位阻. 根据以上原则我们选取KLH作为载体，连接方法为戊二醛法，最终成功的将12肽与KLH连接，打点印迹表明偶联物能与Avastin结合，12肽与载体蛋白偶联后结构未受影响. 小分子物质与载体连接后需要测定两种物质的结合比，方法有化学法、放射性示踪法、分光光度法等. 本试验中，我们在对12肽、KLH、连接产物进行的紫外全波段扫描中发现这3种物质在280 nm处均有吸收峰，于是决定使用分光光度法测定结合比，成功测得偶联物中12肽与KLH结合比为520. 试验表明，分光光度法具有操作简便，安全性高、结果比较可靠的优点.

【】
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