黑色素浓集激素受体2基因siRNA重组腺病毒载体构建及鉴定
【摘要】 目的: 构建黑色素浓集激素受体2（MCHR2）siRNA重组腺病毒载体,并在稳定表达MCHR2的仓鼠卵巢（CHO）细胞中鉴定其干扰作用. 方法： 人工合成靶向MCHR2的siRNA干扰序列，用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES?HUS上，得到pSES?HUS?MCHR2siRNA，并与腺病毒骨架质粒pAdeasy?1在BJ5183细菌中进行同源重组，得到pAdeasy?SES?HUS?MCHR2siRNA，在HEK293细胞中包装成重组腺病毒，感染稳定表达MCHR2的CHO细胞株, RT?PCR及Western Blot检测腺病毒对细胞MCHR2表达的影响. 结果： 成功构建MCHR2siRNA重组腺病毒载体. MCHR2siRNA重组腺病毒显著抑制CHO细胞中MCHR2的表达. 结论： 构建的Adeasy?MCHR2 siRNA腺病毒能有效地抑制CHO细胞中MCHR2表达，为研究MCHR2的功能及其与肥胖的关系提供了有效的工具.
【关键词】 腺病毒载 黑色素浓集激素受体 RNA干扰
0引言
黑色素浓集激素（MCH）是中枢作用的一种神经肽，可以调节进食、能量代谢及情绪变化. David等［1］发现MCH的受体MCHR2可能是引起儿童肥胖的候选基因之一. RNA干扰(RNA interference，RNAi)是双链RNA介导的、序列特异的转录后基因沉默(PTGS)现象，其主要生物学功能在于抵抗病毒感染，维持基因组中转座子的稳定性，清除异常RNA，并参与基因表达的调控. 我们研究小组已经筛选出了针对MCHR2的有效的干扰序列，我们用该序列构建针对MCHR2基因重组腺病毒干扰载体，在稳定表达MCHR2的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中检测干扰效果，为研究肥胖机制及其基因提供新思路及新工具.
1材料和方法
1.1材料针对MCHR2基因的干扰序列1：5′?AAGACGGTGTTGAGAGTTGTTTT?3′;序列2： 3′?TTTTCT GCCACAACTCTCAACAA?5′. 大肠埃希菌DH5α，HEK293细胞，pSES?HUS，pAdeasy?1,稳定表达MCHR2的CHO细胞(重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室)；限制性内切酶SfiⅠ，KpnⅠ，EcoRⅤ和T4 DNA连接酶(TaKaRa公司)；限制性内切酶PacI和PmeI(New England Biolab公司)；质粒提取试剂盒（美国Omega生物技术公司）；凝胶回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；DMEM培养基(Gibico公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；Lipo?fectamineTM2000（Invitrogen公司）；RT?PCR试剂盒(TOYOBO公司)和TRIZOL试剂(北京鼎国生物技术有限责任公司)；膜蛋白提取试剂盒（凯基生物有限公司）；MCHR2多克隆抗体、兔抗人β?actin多克隆抗体(Santa Cruz公司)和辣根酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(武汉博士德公司)；所需引物均由上海生工合成.
1.2方法
1.2.1pSES?HUS?MCHR2siRNA载体的构建用SfiⅠ酶切pSES?HUS质粒，胶回收酶切片段. 将靶向MCHR2的干扰序列退火成为双链DNA片段，克隆到酶切后的pSES?HUS质粒中，胶回收连接产物，转化DH5α菌，卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，提取质粒，用KpnⅠ，EcoRⅤ双酶切鉴定正确后送上海生工测序，获得含小干扰RNA(siRNA)表达框的腺病毒穿梭质粒pSES?HUS?MCHR2siRNA，其图谱如图1.
图1pSES-HUS-MCHR2siRNA图谱（略）
1.2.2pAdeasy?SES?HUS?MCHR2siRNA，pAdeasy?SES?HUS载体的构建用CaCl2法将pAdeasy?1转化到BJ5183感受态细菌中，pSES?HUS?MCHR2siRNA，pSES?HUS质粒用PmeⅠ酶切线性化，CaCl2法转化到BJ?easy感受态细菌．卡那霉素及链霉素抗性培养基筛选阳性克隆，提取质粒．用PacⅠ酶切鉴定质粒并转化DH5α感受态细胞中保存.
1.2.3重组腺病毒的包装与病毒滴度测定①包装细胞培养：含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基，37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养HEK293细胞，当细胞汇合度达70％～80％ 时转染；②重组腺病毒载体转染HEK293细胞：重组质粒pAdeasy?SES?HUS?MCHR2siRNA，pAdeasy?SES?HUS用PacⅠ酶切后回收，按照Lipo?fectamineTM2000说明书转染25 mL瓶中的HEK293细胞，10～12 d后收集细胞，-80℃与37℃反复冻融3次，裂解细胞以收获原始病毒，病毒感染HEK293细胞使病毒大量扩增．重复上述步骤，最终收集3轮扩增的病毒液，分装保存于-80℃；③病毒滴度的测定：参照Kaneto等［2］的GFP阳性细胞计数法计数细胞的红色荧光.
1.2.4RT?PCR检测CHO细胞MCHR2转录水平的变化重组腺病毒感染CHO细胞48 h后，提取实验组和对照组细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，按照TOYOBO说明书进行cDNA第1链的合成，以反转录得到的cDNA为模板进行PCR反应. MCHR2上下游引物分别是p1：5′?TGCAATCCCAGTGTACCAAA?3′，p2：5′?CCCACATAGAAGGCCAGTGT?3′，反应产物长度为152 bp；内参照β?actin上下游引物分别是p1：5′?ACGAGACCACCTTCAACTCCATC?3′，p2：5′?TAGAAGCATTTGCGGTGGACGA?3′，扩增片段大小为304 bp. 反应条件为：94℃预变性2 min，再94℃15 s→55℃ 15 s→72℃ 20 s，共30个循环，最后72℃延伸5 min. 20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，比较干扰组与对照组mRNA水平表达差异.
1.2.5Western Blot检测重组腺病毒对MCHR2蛋白表达的影响在重组腺病毒感染CHO细胞48 h后提取细胞膜蛋白进行Western Blot检测. 每孔上样30 μg，蛋白样品经SDS?PAGE分离后，电转移到PVDF膜上．依次加入50 g/L脱脂奶粉(室温封闭1 h)，1∶200 MCHR2抗体(4℃孵育过夜)，1∶2000的HRP酶标兔抗羊二抗(室温孵育2 h)．TBST缓冲液洗涤，加入化学发光剂显影.
2结果
2.1pSES?HUS?MCHR2siRNA载体的鉴定KpnⅠ，EcoRⅤ双酶切鉴定6个克隆，进行琼脂糖凝胶电泳，阳性克隆载体只被KpnⅠ单酶切，pSES?HUS被切成6790 bp和1798 bp片段（图2），与实验设计相符. 2泳道的质粒测序鉴定结果正确.
M：D15000 marker； 1~6：pSES?HUS?MCHR2siRNA； 7：pSES?HUS.
图2穿梭载体酶切鉴定（略）
2.2pAdeasy?SES?HUS?MCHR2siRNA，pAdeasy?SES?HUS载体构建pSES?HUS?MCHR2siRNA,pSES?HUS质粒用PmeⅠ酶切后与pAdeasy?1在细菌BJ5183内进行同源重组. 得到pAdeasy?SES?HUS?MCHR2 siRNA，pAdeasy?SES?HUS载体，PacⅠ酶切鉴定正确(图3). 证明骨架载体同源重组成功.
M：λDNA/HindⅢ marker； 1：pAdeasy； 2：pAdeasy?SES?HUS； 3：pAdeasy?SES?HUS?MCHR2siRNA； 4：PacⅠ酶切pAdeasy?SES?HUS； 5：PacⅠ酶切 pAdeasy?SES?HUS?MCHR2siRNA.
图3PacⅠ酶切重组腺病毒载体（略）
2.3重组Adeasy?SES?HUS?MCHR2siRNA，Adeasy?SES?HUS腺病毒的包装重组腺病毒质粒载体转染包装细胞HEK293,第2日在倒置荧光显微镜下可见少量红色荧光. 1 wk后可见大约40％的红色荧光. 第12日，可见大部分包装细胞肿胀脱落，荧光显微镜观察视野满布红色荧光（图4），表明重组腺病毒构建成功. 重组腺病毒滴度：Adeasy?SES?HUS?MCHR2 siRNA为6.5×1011pfu/L，Adeasy?SES?HUS为5.4×1011pfu/L.
图4腺病毒表达的红色荧光蛋白×10 （略）
2.4稳定表达MCHR2的CHO细胞中MCHR2基因表达包装完成的病毒颗粒以3×107pfu总量感染50 mL培养瓶的CHO细胞，48 h后收集细胞总RNA及膜蛋白，检测其变化. RT?PCR结果表明，干扰组与对照组细胞相比，MCHR2基因mRNA量明显降低（图5)；Western Blot结果显示，干扰组的MCHR2蛋白表达量显著减少（图6).
M：markerⅠ； 1： 对照组MCHR2 ； 2：干扰组 MCHR2； 3，4：对照组与干扰组β?actin.
图5对照组与干扰组RT?PCR结果（略）
1：干扰组； 2：对照组.
图6对照组与干扰组Western Blot结果（略）
3讨论
MCH是新近发现的一种下丘脑神经肽，由19个氨基酸组成,可以调节进食、能量代谢及情绪. 啮齿类动物中枢急性给予MCH会刺激进食，长期给予将引起肥胖及高胰岛素血症. 过表达MCH的小鼠摄食增多，轻度肥胖，并出现高血糖和胰岛素抵抗. 相反，缺乏MCH的小鼠（MCH敲除小鼠）摄食减少，瘦弱，代谢增高. 因此MCH与肥胖的关系非常密切［3］.
目前已经克隆出两种MCH受体：MCHR1和MCHR2. MCHR1与MCHR2分别由353和340个氨基酸残基组成，都是有7个跨膜α螺旋的G蛋白偶联受体超家族（GPCRs）I类成员. MCHR1主要分布于大脑皮质、海马、丘脑、中脑、脑桥及下丘脑的腹内侧核、背内侧核和弓状核，它可在啮齿类及多种高等动物体内表达. MCHR2可分布于大脑皮质、海马、下丘脑，它不能在啮齿动物体内表达，目前发现MCHR2只在人、恒河猴、犬、野猪、白鼬中有表达［4-5］. 两种受体的分布区域都与摄食中枢、能量代谢及情绪调节有关. 动物模型证实MCHR1与肥胖、焦虑及抑郁密切相关. MCHR1基因敲除的小鼠瘦弱，活动增加. 另外，这些受体敲除小鼠摄食增加，代谢改变，并对饮食所至的肥胖有抵制作用［6］. 目前国内外关于MCHR2的研究进展十分缓慢，它与肥胖的关系也未研究清楚. 我们成功构建了MCHR2siRNA腺病毒，可以用于以后的动物实验，进而对MCHR2的功能及它和肥胖的关系进行深入研究.
在本实验中，我们采用He等［7］创建的pAdeasy腺病毒载体系统，通过细菌体内同源重组的方法，构建针对MCHR2基因的siRNA重组腺病毒载体．该方法不但发挥了重组腺病毒高效、安全等优点，同时，还具有重组效率高、包装时间短等特点．腺病毒载体介导的RNA干扰克服了以往用质粒作为siRNA输送载体转染效率低的缺陷. 实验中我们使用RT?PCR，Western Blot的方法在mRNA水平和蛋白质水平证实针对MCHR2基因的siRNA重组腺病毒有效地抑制了MCHR2基因的表达. 表明腺病毒是一种有应用前景的研究功能未知基因MCHR2工具. Adeasy?SES?HUS?MCHR2 siRNA还可用于动物实验，为研究MCHR2与肥胖的关系提供了新思路.
【】
［1］ David M, Cecile L, Jerome D, et al. A Genome?Wide Scan for Childhood Obesity ?Associated Traits in French Families Shows Significant Linkage on Chromosome 6q22.31-q23.2 ［J］. Diabetes, 2004,53: 803-811.
［2］ Kaneto H, Xu G, Song KH, et al. Activation of the Hexosamine Pathway Leads to Deterioration of Pancreatic β?Cell Function through the Induction of Oxidative Stress ［J］.J Biol Chem,2001,276(33):31099-31104.
［3］ Gabriella S L, Richard L, Bradley EK, et al. Melanin?concentrating hormone is a critical mediator of the leptin?deficient phenotype［J］. PNAS, 2003, 100:10085-10090.
［4］ Suke W, Jiang B, Kim O, et al. Identification and Pharmacological Characterization of a Novel Human Melanin?concentrating Hormone Receptor, MCH?R2［J］. J Biol Chem, 2001, 276(37): 34664-34670.
［5］ Songzhu A, Gene C, Jack JZ, et al. Identification and characterization of a melanin?concentrating hormone receptor［J］. PNAS, 2001, 98(13):7576-7581.
［6］ Donald JM, Drew TW. Melanin?concentrating hormone 1 receptor?deficient mice are lean, hyperactive, and hyperphagic and have altered metabolism［J］. PNAS, 2002, 99:3240-3245.
［7］ He TC，Zhou S，Costa LT，et a1．A simplified system for generating recombinant adenoviruses ［J］．PNAS,1998, 95(5)：2509?2514.
