格列吡嗪对正常及糖尿病大鼠心肌线粒体ATP敏感性钾通道的影响

来源:岁月联盟 作者:吴国亭 时间:2010-07-12

【摘要】  目的: 探讨格列吡嗪(Glip)对正常及糖尿病大鼠心肌线粒体ATP敏感性钾通道(mito KATP)的影响. 方法: 取分离鉴定的Wister大鼠和2型糖尿病GK大鼠心肌组织线粒体悬浮液,加入到含有K+和KATP通道阻滞剂ATP的待测溶液中,再按如下分组进行药物干预,即空白对照组(Con组)、特异性mitoKATP激活剂二氮嗪组(Dia组)、Dia+Glip组(分别为5,50 μmol/L Glip),即刻检测溶液在3 min内光散射值的变化,以此作为反映线粒体体积变化的指标. 结果: 各组线粒体体积均随时间增大,Con组增加速度极慢,Dia组最快,而Dia+Glip组则介于两者之间.不同浓度Glip均能使两种大鼠线粒体体积增加速度减慢(P<0.01),高浓度作用更明显(P<0.01);相同浓度Glip对不同大鼠组的影响程度不同,对糖尿病GK大鼠的影响明显弱于正常大鼠(P<0.01). 结论: Glip对正常及糖尿病大鼠心肌mitoKATP均有关闭作用,但对糖尿病大鼠的作用明显较弱. 相当于临床中血药浓度峰值的Glip浓度(5 μmol/L)虽可干扰正常大鼠心肌mitoKATP的活性,但对糖尿病大鼠心肌mitoKATP无显著影响.

【关键词】  格列吡嗪 糖尿病 心肌 线粒体ATP敏感性钾通道


    0引言

    磺脲类药物因为高效的降糖作用而广泛应用于2型糖尿病的治疗. 它主要通过结合胰岛β细胞膜上磺脲类药物受体(sulfonylurea receptor,SUR)引起细胞膜上ATP敏感性钾通道(ATP?sensitive potassium channels, KATP)关闭而发挥作用.但研究证实大部分磺胺类药物也能关闭心血管组织的KATP[1]. 而后者在心肌缺血时的激活对于启动心肌缺血预适应(ischemic preconditioning,IPC),降低缺血对心肌的损伤发挥着主要作用,并且线粒体ATP敏感性钾通道(mitoKATP)相对于细胞膜ATP敏感性钾通道所起的作用更重要,mitoKATP是IPC的最终效应器[2-3].目前已明确磺脲类药物格列吡嗪(Glip)对心血管组织sarcKATP有阻滞作用,但少见其对心血管mitoKATP直接影响的报道. 我们应用线粒体悬浮液定量光散射测定技术研究Glip对正常及糖尿病大鼠心肌mitoKATP的影响,探讨Glip对缺血性心肌的安全性、指导临床对缺血性心脏病患者降糖药的选择.

    1材料和方法

    1.1材料8~9 wk雄性Wister大鼠和糖尿病Goto?Kakizaki(GK)大鼠各20只,体质量220~250 g(上海斯莱克实验动物有限公司);Glip纯品(上海信谊内分泌公司);蔗糖、硫酸铜、酒石酸钾钠、琥珀酸钠、丙二酸、延胡索酸(国药集团化学试剂有限公司);蛋白酶(Invitrogen公司);牛血清白蛋白(Spanish公司);二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)(Amresco公司);HEPES,ATP(Roche)公司;Percoll(Pharmacia公司);二氮嗪(Diazoxide),鱼藤酮、寡霉素(Sigma公司);高速冷冻离心机(Beckman公司);723型可见分光光度计(上海精密仪器有限公司).

    1.2方法

    1.2.1线粒体制备大鼠禁食过夜,断头处死,迅速取出心脏. 依据Riess等[4]的方法提取线粒体,略作改动,简述如下:用少量冰预冷分离介质(250 mmol/L蔗糖,10 mmol/L HEPES,5 mmol/L K?EGTA,用NaOH调pH至7.2)漂洗心脏,在含1 g/L蛋白酶的分离介质中剪碎心脏至肉糜状,分离介质用5 g/L牛血清白蛋白调整至2.5倍体积,用匀浆器制成匀浆液,1700 g离心4 min,取上清液9000 g离心5 min,将沉淀吹打重悬浮于分离介质中,2300 g离心2 min,收集上清液,9000 g离心5 min,得到线粒体沉淀,将沉淀重悬浮于不含K?EGTA的分离介质中.采用自发形成Percoll密度梯度的方法进一步纯化线粒体.最后将所得线粒体沉淀以蛋白浓度35~40 g/L悬浮在不含K?EGTA的分离介质中,冰浴中保存备用. 以上操作均在0~4℃进行,从动物处死到首次离心间隔少于4 min. 参照Castilho等[5]方法 ,用测定线粒体内膜关键酶琥珀酸脱氢酶活性法进行线粒体鉴定. 双缩脲法测定线粒体蛋白浓度.

    1.2.2线粒体体积测定用定量光散射技术测定线粒体体积变化. 当线粒体悬浮液中线粒体蛋白浓度为0.1 g/L时,在经过蛋白浓度无限大时吸光度值校正后,线粒体悬液光散射值β与溶液在520 nm,25℃的吸光度值的倒数呈线性相关[4]. 因此反映线粒体体积变化的线粒体悬液β值可由这两个吸光度值所得[6]. 实验中线粒体悬液为含K+待测溶液,包括120 mmol/L KCl,10 mmol/L HEPES,0.1 mmol/L EGTA,10 mmol/L琥珀酸盐,0.5 mmol/L MgCl2,5 mmol/L 磷酸盐,5 μmol/L鱼藤酮,0.67 μmol/L寡霉素,200 μmol/L ATP(KATP阻滞剂) ,pH7.2. 取分离鉴定的Wister大鼠和2型糖尿病GK大鼠心肌组织线粒体,加入到上述待测溶液中(线粒体蛋白终浓度为0.1 g/L),再按如下实验分组进行药物处理,即刻用723型可见分光光度计监测溶液3 min内在520 nm,25℃的吸光度值变化,然后换算成光散射值β. 实验数据以线粒体悬液光散射值变化百分比(β%)表示Glip对线粒体体积变化的影响程度. β%=Δβ(Glip)/Δβ(Dia) =[β(Glip)-β(Con)]/[β(Dia)-β(Con)]×100%[4],其中β(Con),β(Glip),β(Dia)分别是实验特定时间点对照组、Glip组和二氮嗪组β值.

    1.2.3动物分组将Wister大鼠和GK大鼠各分4组. ① 二氮嗪组(Dia组):加入特异性mitoKATP激活剂二氮嗪(30 μmol/L);② Glip低剂量组(Glip1组):二氮嗪后加入5 μmol/L Glip;③ Glip高剂量组(Glip2组),二氮嗪后加入50 μmol/L Glip;④ 空白对照组(Con组):加入相应体积的含K+待测溶液. 其中Glip和二氮嗪溶解于0.5 mL/L DMSO中,在本实验条件下,0.5 mL/L DMSO对实验结果无影响.

    统计学处理:数据以x±s表示,应用SPSS13.0软件进行统计学分析,两组间均数比较应用t检验,两组以上均数比较应用方差分析,方差齐性用最小显著差法(LSD)检验,P<0.05为差异具有统计学意义.

    2结果

    2.1各组大鼠心肌线粒体体积随时间的变化各组的线粒体悬液光散射值(β值)均随时间有程度不等升高(图1,2). 各大鼠心肌线粒体悬液光散射值β在空白对照组上升速度非常缓慢,在加入二氮嗪后速度明显加快. 两者在Wister大鼠实验结束时(3 min时间点)β值分别为0.2040±0.0016,0.2410±0.0017,差别具有显著统计学意义(P<0.01);两者在GK大鼠实验结束时β值分别为0.2071±0.0011,0.2337±0.0031,差别具有显著统计学意义(P<0.01);两者3 min时间点β值相对于实验起始点增加百分比在Wister大鼠分别是(6.5±0.7)%和(26.2±2.8)%,差别具有统计学意义(P<0.01),在GK大鼠分别是(5.4±0.9)%和(19.6±3.4)%,差别具有统计学意义(P<0.01).

    2.2Glip对大鼠心肌线粒体体积变化的影响加入5,50 μmol/L Glip后,线粒体体积增加速度减慢,线粒体悬液β值随实验时间延长较二氮嗪组下降明显(图1,2). 图3为实验各组在加入药品后120 s时的β%值,不同浓度Glip均会使Wister和GK大鼠心肌线粒体体积增加速度减慢,高浓度组的影响较低浓度组更明显,差异具有显著统计学意义(P<0.01). 在不同大鼠组别中,相同浓度的Glip降低心肌线粒体体积增加速度的程度不同,对GK大鼠的影响明显弱于Wister大鼠组(P<0.01),并且随着Glip浓度增加,两者之间的差异也变大.

    3讨论

    我们采用线粒体悬液定量光散射测定技术研究了Glip对大鼠心肌组织线粒体KATP通道的影响. 发现在含有mitoKATP抑制剂ATP的大鼠心肌线粒体悬液中,线粒体体积增加缓慢,而加入特异性mitoKATP激活剂二氮嗪后线粒体体积急剧上升,这与Costa等[6]的研究结果相一致,表明在本实验条件下线粒体体积的增加是mitoKATP开放的结果.

    我们发现加入Glip使二氮嗪引起的线粒体体积增加程度明显下降,并且呈浓度依赖性,即高浓度组的作用较之低浓度组更明显,从而证实Glip能够关闭mitoKATP. 由于mitoKATP在缺血预适应保护心肌中发挥着不可替代的作用,因而关于其分子结构的研究报道很多,最近Cuong等[7]发现磺脲类药物受体2(SUR2)而非SUR1参与了大鼠心肌mitoKATP的构成,并且已有研究表明Glip虽然亲和力很低,也能够与心血管组织sarcKATP上的SUR2亚单位结合. 因此Glip关闭大鼠心肌mitoKATP可能是它与mitoKATP上SUR2亚单位结合的结果. Glip虽可关闭mitoKATP,但它的这种作用较之格列本脲明显弱. 既往研究表明50 μmol/L格列本脲几乎完全阻断mitoKATP的开放,而本实验结果显示50 μmol/L Glip仅能使mitoKATP活性下降约一半,显示出Glip对KATP通道的选择性明显高于格列本脲,对心肌mitoKATP的亲和力极低,即使在相当于临床中血药浓度峰值的浓度(5 μmol/L)下它对心肌mitoKATP的作用也很微弱.这可以解释Flynn等[8]的研究结果,该研究发现Glip并不影响麻醉大白兔的心肌缺血预适应.

    我们同时也比较了Glip对正常及2型糖尿病大鼠心肌组织mitoKATP的影响,发现相同浓度的Glip对糖尿病大鼠心肌mitoKATP的关闭作用较之正常组明显减弱,提示糖尿病状态下心肌mitoKATP对Glip的反应性降低,推测具体机制有:糖尿病时氧化应激和蛋白糖基化使得mitoKATP对刺激的敏感性下降[9-10],糖尿病时细胞代谢水平的降低也减弱了mitoKATP对药物的反应能力. 并且研究也发现,Glip在相当于血药浓度峰值的浓度下,对正常大鼠心肌mitoKATP有轻微关闭作用,但对糖尿病心肌mitoKATP不产生具有统计学意义的影响.

    总之,通过以上研究表明,Glip对正常及糖尿病大鼠心肌mitoKATP均有关闭作用,但对糖尿病大鼠的作用明显较弱,因而在有必要进行明确其中机制研究的同时,也必须认识到在非糖尿病状态下得出的关于Glip对心肌缺血预适应影响的结果并不适用于糖尿病状态. 相当于血药浓度峰值的Glip虽可干扰正常大鼠心肌mitoKATP的活性,但对糖尿病大鼠心肌mitoKATP无显著影响,这提示我们临床治疗剂量的Glip对于缺血心肌可能是安全的.

   

【】
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[5] Castilho RF, Vicente JA, Kowaltowski AJ, et al. 4,6?Dinitro?o?cresol uncouples oxidative phosphorylation and induces membrane permeability transition in rat liver mitochondria[J]. Int J Biochem Cell Biol, 1997,29:1005-1011.

[6] Costa AD, Quinlan CL, Andrukhiv A, et al. The direct physiological effects of mitoK(ATP) opening on heart mitochondria[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006,290:H406-H415.

[7] Cuong DV, Kim N, Kim E, et al. Detection of Mitochondrial ATP?sensitive potassium channels in rat cardiomyocytes[J]. Korean J Physiol Pharmacol, 2004,8:201-206.

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