出血性脑梗死大鼠脑损伤机制及三磷酸腺苷敏感性钾通道的作用

【摘要】  目的: 验证KATP通道是否参与出血性脑梗死的病理过程，探讨HI继发脑损伤的机制. 方法: 健康雄性Sprague?Dawley大鼠96只，随机分为出血性脑梗死（hemorrhagic infarction, HI）组、单纯脑梗死（cerebral infarction,CI）组、格列苯脲（Glibenclamide,Gli）干预(Gli+HI,GH)组和假手术(Sham)组. 应用两步法建立HI大鼠模型. 术后3,6,12,24 h进行神经功能评分、脑组织含水量及脑组织三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase, ATPase）,琥珀酸脱氢酶（succinic dehydrogenase,SDH）,丙二醛（malondialdehyde,MDA）测定. 结果： HI组和CI组大鼠术后各时间点神经功能评分、脑组织含水量差别无统计学意义(P>0.05). HI组大鼠脑组织ATPase活性术后12,24 h高于CI组(P<0.05), SDH活性术后24 h高于CI组(P<0.05)，MDA含量术后12 h低于CI组(P<0.05)；以上现象均可被Gli取消. 结论： 应用两步法制作的HI大鼠模型较为稳定、可行. CI后继发中等量出血后早期，脑组织对缺血缺氧耐受性增强，延缓了脑损伤，与KATP通道开放有关.

【关键词】  脑出血 脑梗死 疾病 模型 动物 三磷酸腺苷敏感性钾通道 腺苷三磷酸酶 琥珀酸脱氢酶 丙二醛

    0引言

    脑血管病是导致人类死亡的三大疾病之一，以缺血性脑血管病最常见，约占全部脑血管病的80%，病死率和致残率均高. 早期溶栓是急性期脑梗死(cerebral infarction,CI)有效的方法，部分患者在溶栓治疗后继发脑出血，形成出血性脑梗死(hemorrhagic infarction,HI)，病理过程较为复杂. 我们应用两步法建立HI大鼠模型，对HI和CI早期神经功能缺损、脑水肿及脑组织三磷酸腺苷酶(adenosine triphosphatase, ATPase),琥珀酸脱氢酶(succinic dehydrogenase, SDH)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)进行对比研究，并应用三磷酸腺苷敏感性钾通道(adenosine triphosphate sensitive potassium channels,KATP通道)抑制剂格列苯脲(Glibenclamide,Gli)进行干预，验证KATP通道是否参与HI的病理过程，对HI的病理机制进行初步探讨.

    1材料和方法

    1.1材料立体定向仪（SR?6N, Japan）；ANDHR?120天平（日本，精确度为0.1 mg）；恒温干燥箱（北京市朝阳区来广营医疗器械厂）；303?4A型隔水式培养箱（南通仪器厂）； -80℃冰箱（日本）；玻璃匀浆器；721分光光度计；手术相关器械；自制行为学评分器械；三磷酸腺苷酶测试盒、琥珀酸脱氢酶测试盒及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；格列苯脲（Sigma）;液氮及各种实验室常用试剂.

    1.2方法

    1.2.1实验动物与分组成年健康雄性Sprague?Dawley 大鼠96只，体质量250～280 g，由河北医科大学基础医学院动物实验中心提供，以标准饲料喂养和饮用纯净水，使用动物专用洁净垫料，恒温20～25℃. 随机分为4组：① HI组；② CI组；③ Gli+HI(GH)组；④ 假手术(Sham)组. 每组按时间分为术后3，6，12，24 h共4个亚组，每个亚组6只大鼠.

    1.2.2动物模型的建立应用本实验室的两步法制作HI大鼠模型：大鼠称质量后麻醉. 第一步，参照Longa等［1］和Laing等［2］的线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉闭塞（middle cerebral occlusion，MCAO）模型. ① 大鼠仰卧位固定于手术台，取颈部正中切口约3 cm. 暴露右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）,颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA）. ② 结扎、离断ECA的分支，在距CCA分叉3～4 mm处结扎并离断ECA. ③ 在ECA残端剪一0.2 mm的小口，将制备好的线栓（直径0.235 mm，头端呈球形）插入，并沿ICA插入颅内，进线长度距CCA分叉处(18.5±0.5) mm，进线有轻微阻力感时停止. 结扎、剪断线栓尾端部分，常规逐层缝合切口. 第二步，参照Hua等［3］及本实验室改良的方法［4］，将50 μL自体尾动脉血注入尾状核部位. ① MCAO造模成功后，随即将大鼠固定于立体定向仪，暴露Bregma点. ② 取Bregma点右侧中线旁3 mm,向前1 mm，用牙科钻钻一直径1 mm的圆孔，深度达硬脑膜. ③ 将大鼠双下肢翻转朝上固定，在尾根部腹侧面作一约2～3 cm的纵形切口，暴露尾动脉. 用生理盐水冲洗过的微量注射器抽取不加抗凝剂的尾动脉血50 μL. ④ 迅速将微量注射器固定于事先调整好的立体定向仪上，进针深度距骨面6.5 mm，缓慢注入血液（注射时间2 min），注射完毕留针10 min. 医用骨蜡封闭钻孔，常规缝合头部皮肤，加压包扎尾部切口. CI模型采用线栓法制作大鼠右侧MCAO模型，步骤同上. GH模型在制作HI模型前30 min采用立体定向技术脑室注射Gli. 取Bregma点右侧中线旁2 mm，向后1.2 mm，进针深度4.5 mm［5］，缓慢注射Gli(10 μmol/L) 8 μL，注射时间约1 min. Sham模型制作步骤同HI模型，但线栓插入后随即拔出，脑实质穿刺后不注入血液，留针10 min.

    1.2.3神经功能评分模型制作成功后分别在术后3，6，12，24 h进行神经功能评分，采用Longa评分法［1］、Berderson评分法［6］、平衡木评分法［7］.

    1.2.4脑组织含水量测定神经功能评分完毕后将大鼠麻醉、断头处死，取出完整的脑组织，沿注血进针孔平面冠状切割脑组织（此切割平面距额极约7 mm，CI模型亦按此部位切割），取前2 mm右侧脑组织进行含水量测定：采用干湿质量法, 公式为（脑组织湿质量－脑组织干质量）/湿质量×100%. 测质量用电子天平, 测质量后将脑组织放入95℃烤箱内烘干24 h，反复称量至恒质量.

    1.2.5脑组织ATPase，SDH，MDA测定脑组织切割方法同前，取后2 mm右侧脑组织经液氮速冻后，称质量，-80℃冰箱保存. 测定时所有标本同批次进行：在4℃环境下，根据脑组织质量按照1∶9比例加入冰生理盐水，用玻璃匀浆器将组织研磨制成匀浆. 将制备好的组织匀浆以3000~4000 r/min低温离心10 min后取上清液，分别进行ATPase，SDH，MDA测定及蛋白定量，均严格按照试剂盒说明操作.

    统计学处理：采用SPSS10.0统计软件进行统计学分析，检测结果以x±s表示. 多组间比较采用单因素方差分析（One?way ANOVA）,当方差分析差异有统计学意义时，进一步用SNK?q检验进行两两比较，检验水准取α=0.05.

    2结果

    2.1神经功能评分术后HI组和CI组大鼠均出现行为和功能异常，出现不同程度左侧肢体瘫痪和右侧Horner征. 术后3，6，12，24 h HI和CI组三项评分均高于Sham组，HI和CI组间三项评分差异均无统计学意义（P>0.05，图1）.

    2.2脑组织含水量测定HI和CI组病变侧脑组织含水量均在术后3 h开始升高，术后12，24 h明显升高. 两组在各时间点间差异无统计学意义（P>0.05，表1）.表1术后不同时间点脑组织含水量

    2.3脑组织ATPase，SDH活性及MDA含量HI和CI组病变侧脑组织ATPase活性术后3，6 h差异无统计学意义（P>0.05，表2）；术后12，24 h HI组病变侧脑组织ATPase活性高于CI组（P<0.01，表2）. GH组病变侧脑组织ATPase活性术后各时间点均低于HI组（P<0.01，表2）；术后3，6 h GH组病变侧脑组织ATPase活性低于CI组（P<0.01，表2）；术后12，24 h GH组与CI组差异无统计学意义（P>0.05，表2）.

    HI，CI，GH组病变侧脑组织SDH活性术后3 h差异无统计学意义（P>0.05，表3）；术后6，12 h HI和CI组病变侧脑组织SDH活性高于GH组（P<0.05，表3），HI组与CI组差异无统计学意义（P>0.05，表3）；术后24 h HI组病变侧脑组织SDH活性高于CI和GH组（P<0.05，表3），CI组与GH组差异无统计学意义（P>0.05，表3）.

    HI组病变侧脑组织MDA含量术后12 h低于CI组和GH组（P<0.01，表4）；术后24 h HI，CI，GH组差异无统计学意义（P>0.05，表4）.表2术后不同时间点脑组织ATPase表3术后不同时间点脑组织SDH 表4术后不同时间点脑组织MDA

    3讨论

    HI在脑缺血后继发出血性改变，梗死区中的血液成分可对缺血损伤后的细胞产生进一步的影响. 应用两步法将脑梗死和脑出血动物模型结合建立HI大鼠模型，模拟先出现CI然后继发出血的病理过程，用于研究自身动脉血液成分对脑梗死组织的影响. 选用尾动脉作为供血动脉，不影响大鼠肢体的功能，使神经功能评分更准确，成功率高. 另外，临床上CI后继发出血的量和时间不同，临床表现和预后也不同. 应用两步法建立HI模型，可以通过控制注血量和注血时间观察CI后不同量和不同时期的出血对病情的影响，简单易行、稳定性好.

    HI大鼠和CI大鼠神经功能评分、脑组织含水量变化趋势一致，提示CI后继发中等量出血后血液成分没有加重神经功能缺损和脑水肿. 从脑组织损伤程度看，HI脑组织ATPase，SDH活性较CI降低缓慢，MDA含量一过性低于CI，而抑制KATP通道可以取消以上现象，说明HI早期细胞对缺血缺氧损伤耐受性增强， KATP通道参与了该过程. KATP通道是一种应激活化分子，在生理情况下处于关闭状态，当缺血缺氧时KATP通道被激活，可将细胞代谢和膜电位及兴奋性偶联起来. KATP通道开放对缺血缺氧性脑损伤具有保护作用［8-10］，可能是拮抗缺血性损伤的一种重要的内源性代偿机制. 但这种代偿作用是有限的，会随缺血缺氧时间的延长最终衰竭，造成细胞不可逆受损. 从实验结果看，HI梗死区内的自体动脉血有类似KATP通道开放剂的作用，进一步诱导了KATP通道开放，加强了脑组织对缺血缺氧的耐受性，延缓了脑损伤.

【】
  ［1］ Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke, 1989,20(1):84-91.

［2］ Laing RJ, Jakubowski J, Laing RW, et al. Middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats: Which method works best？［J］. Stroke, 1993,24(2):294-298.

［3］ Hua Y, Schallert T, Keep RF, et al. Behavioral test after intracerebral hemorrhage in the rat［J］. Stroke,2002,33(10):2478-2484.

［4］ 张祥建,刘春燕,祝春华,等. 大鼠自体动脉血脑出血动物模型的建立［J］. 脑与神经疾病杂志,2003,11(6):341-344.

［5］ 包新民,舒斯云. 大鼠脑立体定位图谱［M］. 北京:人民卫生出版社, 1991:31-35.

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