不同热缺血时间再灌注损伤对大鼠移植胰的影响

                作者：刘小南 霍婷婷 王为忠 管文贤 陈冬利

【摘要】目的：探讨不同热缺血时间再灌注对大鼠移植胰的损伤情况。方法：6只正常SD大鼠为对照组，18只糖尿病SD大鼠随机分为WIR 0组（热缺血时间0min,n=6）、WIR 15（热缺血时间15min,n=6）和WIR 30（热缺血时间30min,n=6）。WIR 0组、WIR 15组和WIR 30组均行胰腺移植。观测各组再灌注前后血糖，再灌注后2h血清TNFα和NO的含量、移植胰组织中SOD、MPO和MDA含量，组织学变化及细胞凋亡情况。结果：（1）WIR 0组和WIR 15组较再灌注前血糖即下降，再灌注后WIR 15组和WIR 30组较WIR 0组、WIR 30组较WIR 15组血糖高。（2）再灌注后WIR 0组、WIR 15组和WIR 30组较对照组、WIR 15组和WIR 30较WIR 0组、WIR 30较WIR 15组血清TNFα含量高、NO含量低。（3）再灌注后WIR 0组与WIR 15组和WIR 30组较对照组、WIR 15组和WIR 30组较WIR 0组与对照组、WIR 30组较WIR 15组与对照组胰腺组织中SOD活性低、MDA含量高、MPO活性高。（4）再灌注后2hWIR 0组与WIR 15组和WIR 30组较对照组、WIR 15组较WIR 0组凋亡指数高。（5）WIR 30组供胰组织病理损伤最为严重。结论：缺血再灌注损伤可导致移植胰细胞凋亡；在冷缺血180min的条件下，大鼠供胰的最大耐受热缺血时间为15min。

    【关键词】胰腺移植・缺血・再灌注损伤・大鼠

     Effect of the ischemic reperfusion with the different warm ischemic time on pancreas grafts in rats

      【ABSTRACT】Objective:To investigate the effect of different warm ischemic time on pancreas grafts in rats.Methods:Control group which consist 6 normal SD rats suffer with sham operation,218 steptozozin (STZ)induced diabetic SD rats were randomly assigned to 3 groups:group WIR 0 consisted of 6 diabetic rats which received pancreas transplantation (PT) without warm time ischemic time,Group WIR 15 consisted of 6 diabetic rats which received PT with 15 min ischemic,Group WIR 30 consisted of 6 diabetic rats which received PT with 30 min ischemic time.The blood glucose,NO and TNFα in serum,MDA,SOD,MPO and TUNEL cells in grafts were monitored.Results:(1)The mean blood glucose level of rats post reperfusion in Group WIR 0 and Group WIR 15 was lower than that prereperfusion and that in Group WIR 15 and Group WIR 30 was higher than Group WIR 0 2 hours after reperfusion,WIR 30 was higher than Group WIR 15.(2)The mean TNFα level in serum,MDA and MPO level in grafts in Group WIR 0,WIR 15 and WIR 30 was higher than Group Control 2 hours after reperfusion,and that in Group WIR 15 and WIR 30 was higher than Group WIR 0,and that in Group WIR 30 was higher than Group WIR 15.The mean NO in serum,SOD in grafts level in Group WIR 0,WIR15 and WIR 30 was lower than Group Control2 hours after reperfusion,and that in Group WIR 15 and WIR 30 was lower than Group WIR 0,and that in Group WIR 30 was lower than Group WIR 15.(3)The mean apoptosis index in grafts in Group WIR 0,WIR 15 and WIR 30 was higher than Group Control 2 hours after reperfusion,and that in Group WIR 15 was higher than Group WIR 0.(4)The pathological injury of the grafts in Group WIR 30 were the moist severe.Conclusion:Ischemic reperfusion injury can induce the pancreas graft apoptosis,and with the 180 min cold ischemic time the longest warm ischemic time that the pancreas grafts can endure is 15 min.

    【KEY WORDS】Pancreas transplantation・Ischemic・Reperfusion injury・Rats    胰腺移植（pancreas transplantation,PT）的热缺血和冷保存过程中不可避免地会引起缺血再灌注（ischemic reperfusion,I/R）损伤，继而导致术后许多并发症，严重时可直接威胁供胰和受体的存活。本实验针对不同热缺血时间下大鼠移植胰损伤情况进行探讨，报告如下。

    1  材料和方法

    1.1  材料  SD雄性大鼠150只（250~320g），标准实验室饲养，由第四军医大学动物实验中心提供。血糖监测仪购自美国强生公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、一氧化氮（nitric oxic,NO）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）和细胞凋亡检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子（tumur necrosis factor,TNFα)测试盒购自北京东亚免疫技术研究。

    1.2  方法  正常大鼠6只为对照组。大鼠34只自阴茎静脉注射STZ（65mg/kg）后，18只空腹血糖持续2周超过17.4mmol/L为糖尿病大鼠模型成功。糖尿病大鼠随机分为3组：WIR 0组（热缺血时间0min,n=6）、WIR 15组（热缺血时间 15min组,n=6）和WIR 30组（热缺血时间30min,n=6），以上3组大鼠PT动物模型根据制备［1］，热缺血时间通过阻断脾血管不同时间控制，各组控制冷缺血时间为180min。对照组（n=6）仅行开腹及左肾切除术。各组术前禁食不禁水24h，并肌注氨苄青霉素100mg/kg。氯氨胴100mg/kg ip麻醉。术后肌注氨苄青霉素200mg/kg，24h后正常饮食。各组大鼠于移植前2d经尾静脉取血，再灌注2h后经下腔静脉取血，用血糖监测仪测血糖；部分血样离心（4℃，4000r/min,10min），上清置于-70℃冰箱保存，用相应的试剂盒测定TNFα（放免法）及NO（硝酸盐还原法）。各组大鼠于胰腺再灌注2h后取胰组织，部分保存于-70℃冰箱用相应试剂盒测定MPO和SOD活性（黄嘌呤氧化酶法测定）及MDA含量（改良八木国夫法）；部分组织切成1mm×1mm×0.5mm大小组织块，用25g/L戊二醛固定备行电镜检查；部分组织保存于含40g/L中性甲醛中用于HE和TUNEL染色，光镜检查。

    1.3  统计学处理  数据资料以（x±s）表示，组间显著性差异用方差分析，P＜0.05为有统计学显著差异。

    2  结  果

    2.1  再灌注前、后血糖情况  WIR 0组和WIR 15组较再灌注前血糖下降（P＜0.01,P＜0.05），WIR 30组较再灌注前血糖变化不大（P＞0.05），再灌注后WIR 15组和WIR 30组较WIR 0组血糖高（P＜0.05），再灌注后WIR 30组较WIR 15组糖高（P＜0.05）。见表1。表1  各组再灌注后血糖变化情况

　　2.2  再灌注后血清中TNFα和NO的含量  WIR 0组、WIR 15组和WIR 30组较对照组再灌注后2h血清中TNFα含量高（P＜0.05，P＜0.01,P＜0.01）、NO含量低（P＜0.05,P＜0.01，P＜0.01）；再灌注后WIR 15组和WIR 30较WIR 0组血清中TNFα含量高（P＜0.05,P＜0.01）、NO含量低（P＜0.05,P＜0.01），WIR 30较WIR 15组血清中TNFα含量高（P＜0.05）、NO含量低（P＜0.05）。见表2。

    2.3  再灌注后胰腺组织中SOD、MPO和MDA含量  WIR 0组、WIR 15组和WIR 30组较对照组再灌注后2h移植胰组中SOD活性低（P＜0.05，P＜0.01,P＜0.01），MDA含量高（P＜0.05，P＜0.01,P＜0.01）、MPO活性高（P＜0.05，P＜0.01,P＜0.01）；再灌注后WIR 15组和WIR 30组较WIR 0组较对照组血清胰腺组织中SOD活性低（P＜0.05，P＜0.01）、MDA含量高（P＜0.05，P＜0.01）、MPO活性高（P＜0.05，P＜0.01），再灌注后WIR 30组较WIR 15组较对照组血清胰腺组织中SOD活性低（P＜0.05）、MDA含量高（P＜0.05）、MPO（P＜0.05）活性高。见表2。

    2.4  移植胰组织凋亡情况  WIR 0组、WIR 15组和WIR 30组较对照组再灌注后2h移植胰组织中AI值高（P＜0.05，P＜0.01,P＜0.01），再灌注后WIR 15组较WIR 0组AI值高（P＜0.05），但WIR 30组与WIR 0组无统计学差异（P＞0.05）。见表2。

    2.5  移植胰组织病理变化  对照组胰腺组织结构正常，无中性粒细胞浸润。WIR 0组腺组织结构尚正常，但小叶间质水肿，可见少量中性粒细胞浸润。WIR 15组胰小叶间隙增宽，间质血管扩张充血，大量中性粒细胞浸润，胰腺实质可见散在的点状坏死灶。WIR 30组胰腺组织部分小叶正常结构消失，许多细胞变性坏死，大量中性粒细胞浸润，微血管内可见散在血栓。见图（1~3）。  表2  再灌注后血清TNFα、NO、移植胰MPO、SOD、MDA含量和AI值图2  WIR 15组：大鼠胰小叶间隙增宽，间质血管扩张充血，大量中性粒细胞浸润，胰腺实质可见散在的点状坏死灶（HE，×200）

    3  讨  论

    肝脏缺血再灌注损伤的研究报道［2，3］。本研究表明，缺血再灌注对大鼠移植胰也有明显影响。供胰在热缺血期间，底物不能供给、氧的缺乏、线粒体进行无氧代谢、糖酵解产生酸中毒、线粒体膜改变致脂肪酸转运障碍；复温再灌注阶段，乳酸及分子裂解产物的堆积可造成线粒体渗透性水肿和破坏，并产生多种氧自由基导致对供胰的直接或间接损伤。研究表明，I/R可能是通过以下途径介导胰腺的损伤：①导致胰腺微循环障碍和无复流现象发生［4］；②引起胰腺组织嗜中性粒细胞浸润、黏附和激活，氧自由基和前炎性细胞因子的释放［4］；③激活胰酶，导致胰腺的自我消化，诱发急性胰腺炎［5，6］；④诱导胰腺细胞凋亡［7］。我们发现在同样时间的冷缺血条件下无论有无热缺血，供胰均会有不同程度的损伤，这反映在血糖升高、细胞凋亡增加和血清及供胰组织内一些酶和细胞因子的变化方面。随着热缺血时间的不断延长，胰腺内泌功能的损伤进一步加重，血清中介导炎性反应的重要因子TNFα［8］含量增加；而调节血管张力、血压、器官血流量、血小板功能及改善微循环等作用内源性NO［9］含量减少；氧自由基清除剂SOD消耗加大；反映嗜中性粒细胞凝聚程度的酶MPO活性显著升高；供胰组织内脂质过氧化物产物MDA和细胞凋亡现象增加。数据显示热缺血15min时胰腺损伤尚轻，而热缺血30min时胰腺损伤已非常严重，此时供胰的病破坏导致内泌功能几乎完全丧失，值得一提的是此时细胞凋亡情况与无热缺血时相仿，可能大量细胞已坏死，以上提示大鼠胰腺移植时在冷缺血180min的条件下，供胰的最大耐受热缺血时间为15min。

    参  考  文  献

    ［1］刘小南，王为忠，李开宗，等.大鼠胰肠和胰膀胱单纯胰腺移植模型的比较研究［J］.普通外科杂志，2004，13（10）：741745.

    ［2］吴亚光，吴泰璜，穆庆岭，等.缺血预处理与肝脏缺血再灌注损伤的研究［J］.中国普通外科进展，2002，5(2)：87.

    ［3］王金生，张文海，周勇，等.我院肝脏缺血/再灌注损伤机制与防治研究概况［J］.中国现代普通外科进展，2003，6（4）：248.

    ［4］Kusterer K,Poschmann T,Friedemann A,et al.Arterial constriction,ischemiareperfusion,and leukocyte adherence in acute pancreatitis［J］.Am J Physiol,1993,265:G165G171.

    ［5］Obermaier R,Benz S,Kortmann B,et al.Ischemia/reperfusioninduced pancreatitis in rats:a new model of complete normothermic in situ ischemia of a pancreatic tailsegment［J］.Clin Exp Med,2001，1（1）：5159.

    ［6］Sakorafas GH,Tsiotos GG,Sarr MG.Ischemia/reperfusioninduced pancreatitis［J］.Dig Surg,2000，17(1)：314.

    ［7］刘小南，霍婷婷，王为忠，等.缺血预处理对大鼠移植胰缺血再灌注损伤的保护作用及其与细胞凋亡的相关性［J］.世界华人消化杂志，2005，13（7）：871876.

    ［8］Lichtman SN,emasters JJ.Role of cytokines and cytokine producing cells in reperfusion jury to the livers［J］.Semin,Liver Dis,1999,19(2):7187.

    ［9］Brunner F,Maier R,Andrew P,et al.Attenuation of myocardial ischemia/reperfusion injury in mice withmyocytespecific overexpression of endothelial nitric oxide synthase［J］.Cardiovasc Res,2003，57(1):5562.