甲基亚砷酸对内皮型一氧化氮合酶磷酸化影响

       Study on eNOS phosphorylation induced by monomethylarsonous acid   

　　LI Bing,WANG Yi,SUN Guifan.

　　Department of Occupational Health,School of Public Health,China Medical University(Shenyang 110001,China)

　　Abstract： Objective   To observe the effects of monomethylarsonous acid(MMAⅢ)on eNOS phosphorylation and reactive oxygen species(ROS)generation in bovine aortic endothelial cells(BAEC).Methods   Cultured BAEC was exposed to MMAⅢ(075μmol/L,0～15min)without or with acetylcysteine(NAC)pretreatment(1mmol/L,2h),or iAsⅢ(100μmol/L,0～60min).Western blot was done with the specific antibodies for phosphoeNOSSer1179.Intracellular ROS generation was assessed with the fluorescent probe,2',7'dichlorodihydrofluorescein diacetate(H2DCFDA).Results   MMAⅢ(075μmol/L)caused a rapid increase in phosphorylated eNOSSer1179 at 15min after exposure(P<005).In contrast,up to 100μmol/L iAsⅢ caused the increase of phosphorylated eNOSSer1179 at 30min(P<005).MMAⅢ stimulated the ROS production in live cells.Both the MMAⅢinduced eNOSSer1179 phosphorylation and ROS generation were blocked by NAC pretreatment(1mmol/L,2h).Conclusion   MMAⅢ exposure can induce ROS generation and ROSdependent eNOS phosphorylation.

　　Key words： monomethylarsonous acid(MMAⅢ);arsenic poison;eNOS phosphorylation;reactive oxygen species(ROS)
      
　　无机砷的体内代谢中间产物甲基亚砷酸(MMAⅢ)比无机砷的细胞毒性和遗传毒性更强〔1〕，因此其毒性效应是砷中毒发病机制研究的一个新热点。研究表明，无机砷能够激活人类角质细胞和白血病Jurkat细胞的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化〔2，3〕，还可以诱导产生H2O2和超氧阴离子自由基(O・-2)等活性氧自由基(ROS)〔4〕。本研究观察MMAⅢ对牛主动脉血管内皮细胞(BAEC)的eNOS磷酸化以及ROS产生的诱导作用。

　　1   材料与方法

　　11   主要试剂和仪器   MMAⅢ(CH3AsO，获赠自加拿大Cullen WR实验室)；亚砷酸钠(iAsⅢ，Wako)；N乙酰半胱氨酸(NAC，Wako)；二氯二氢二乙酰荧光素(H2DCFDA，Molecular Probes)；CO2细胞培养箱(Kendro)；电泳仪和转膜装置(Atto)；共聚焦荧光显微镜(Leica microsystems)。

　　12   细胞培养   BAEC培养于高糖培养基（DMEMF12)(sigma)，添加成分包括10％胎牛血清、10U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、10U/ml肝素和5ng/ml成纤维细胞生长因子。37℃，5％CO2常规培养。

　　13   eNOS磷酸化的western blot分析   暴露因素包括MMAⅢ(075μmol/L，0～15min)；iAsⅢ(100μmol／L，0～60min)；或NAC(1mmol／L)预处理2h后，再暴露于MMAⅢ(075μmol／L，0～15min)。加入细胞裂解液收获细胞悬液，低温离心后取上清冻存备用。十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶后进行蛋白印迹（western blot）分析。特异性一次抗体为抗phosphoeNOSSer1179抗体和抗eNOS抗体(分别1：1000稀释)；特异性二次抗体为HRP标记的抗兔或抗小鼠二次抗体。自显影胶片扫描后用Adobe photoshop 701软件处理输出，并进行定量分析。共进行独立实验3次。

　　14   细胞内ROS产生的荧光测定   应用荧光染料H2DCFDA。具体实验步骤为：80％融合的BAEC细胞加入5μmol／L H2DCFDA孵育20min后暴露MMAⅢ(075μmol／L，0～15min)；或NAC(1mmol／L)预处理2h的最后20min加入H2DCFDA共同孵育，然后暴露于MMAⅢ(075μmol／L，0～15min)。用倒置荧光显微镜观测细胞内的ROS产生。激发光和发射光波长分别为480和527nm。共进行独立实验3次。

　　15   统计分析   应用SPSS 100统计软件进行单因素方差分析和q检验。

　　2   结果

　　21   MMAⅢ或iAsⅢ暴露对eNOSSer1179磷酸化的影响   BAEC暴露于075μmol／L MMAⅢ 15min后，eNOSSer1179磷酸化显著增加（P<005)，为对照组的141倍(图1)。而相同实验条件下，100μmol／L iAsⅢ暴露30min才可诱导eNOSSer1179磷酸化（P<005)，为对照组的132倍(图2)。各实验组的细胞内总eNOS蛋白含量没有变化。

　　A：western blot的典型结果

　　图1   MMAⅢ暴露对eNOSSer1179磷酸化的诱导作用（略）

　　A：western blot的典型结果

　　图2   iAsⅢ暴露对eNOSSer1179磷酸化的诱导作用（略）

　　22   MMAⅢ暴露诱导ROS依赖性eNOSSer1179磷酸化和细胞内ROS产生   NAC预处理(1mmol／L) 抑制MMAⅢ(075μnol／L)暴露诱导的eNOSSer1179磷酸(图3)。DCF荧光检测法表明，MMAⅢ(075μmol／L)暴露确实能够诱导BAEC产生蓝绿色荧光，提示有ROS的生成，并且NAC预处理(1mmol／L)后，蓝绿色荧光显著减弱，提示ROS生成可以被抑制。

　　图3   NAC预处理抑制MMAⅢ暴露诱导的eNOSSer1179磷酸化（略）

　　3   讨论

　　Ser1179是eNOS分子2个最重要的磷酸化位点之一。研究表明，Ser1179磷酸化通过在Ser1179基团增加一个负电荷而增加eNOS还原酶区域的流动、以及降低钙调蛋白―eNOS复合物解离这两个方面，引起eNOS活化〔5〕。eNOS磷酸化对于机体的eNOS活化具有重要作用。本研究发现，075μmol／L MMAⅢ暴露15min后，eNOSSer1179磷酸化显著增加，提示MMAⅢ暴露初期可能诱导体内的eNOS活化。iAsⅢ暴露也能够诱导eNOSSer1179磷酸化，但是需要高浓 度和更长的暴露时间，提示iAsⅢ的细胞效应可能是通过其代谢中间产物MMAⅢ间接作用的结果。本研究中，MMAⅢ诱导产生的eNOSSer1179磷酸化能够被抗氧化剂NAC有效抑制，提示内皮细胞产生的ROS可能在其中发挥作用。进一步应用DCF荧光检测观测到MMAⅢ(075μmol／L)暴露产生的荧光，并且这种荧光也可以被NAC预处理所抑制，提示MMAⅢ暴露激活eNOSSer1179磷酸化具有ROS依赖性。本研究表明，MMAⅢ暴露能够诱导细胞内产生ROS以及ROS依赖性eNOS磷酸化。
      
　　(本研究得到中日川医学研究者制度的支持和日本筑波大学熊谷嘉人教授的指导，在此一并表示感谢)

　　

　　〔1〕   Vasken Aposhian H,Zakharyan RA,Avram MD,et al.A review of the enzymology of arsenic metabolism and a new potential role of hydrogen peroxide in the detoxication of the trivalent arsenic species［J］.Toxicol Appl Pharmacol,2004,198:327-335.

　　〔2〕   Souza K,Maddock DA,Zhang Q,et al.Arsenite activation of P13K/AKT cell survival pathway is mediated by p38 in cultured human keratinocytes［J］.Mol Med,2001,7:767-772.

　　〔3〕   Hossain K,Akhand AA,Kawamoto Y,et al.Caspase activation is accelerated by the inhibition of arseniteinduced,membrane raftsdependent Akt activation［J］.Free Radic Biol Med,2003,34:598-606.

　　〔4〕   Kumagai Y,Pi J.Molecular basis for arsenicinduced alteration in nitric oxide production and oxidative stress:implication of endothelial dysfunction［J］.Toxicol Appl Pharmcol,2004,198:450-457.

　　〔5〕   McCabe TJ,Fulton D,Roman LJ,et al.Enhanced electron flux and reduced calmodulin dissociation may explain“calciumindependent”eNOS activation by phosphorylation［J］.J Biol Chem,2000,275:6123-6128.