神经营养素3对大鼠急性脊髓损伤后Fas表达的影响
作者：郭树章 任先军 蒋涛 欧阳忠
【关键词】 脊髓损伤
摘 要：［目的］探讨神经营养素3(NT-3)对脊髓损伤保护作用的分子机制。［方法］105只SD大鼠随机分成3组：对照组(生理盐水组)，实验组(NT3组)，假手术组。用改良Allen's WD法以30gcm致伤SD大鼠制作大鼠全瘫模型，经蛛网膜下腔导管于术后即刻、4、8、12、24h、3、7d注入NT3 20μl(含NT-3 200ng)，对照组在相同时间点给予等容积生理盐水，假手术组只打开椎板后蛛网膜下腔置管，不致伤，不给药。采用免疫组织化学方法检测Fas蛋白在脊髓神经元的表达变化情况。［结果］假手术组中Fas蛋白弱阳性表达，对照组中Fas蛋白4h即出现强阳性表达，24h达高峰，实验组与对照组相比Fas蛋白表达明显减少(P<0．01)。［结论］NT-3能通过抑制Fas蛋白的表达抑制脊髓损伤后神经元凋亡，从而保护损伤的脊髓组织，这可能是NT-3对脊髓损伤具有保护作用的机制之一。
关键词：神经营养素3；脊髓损伤；Fas
Abstract：［Objective］To study the protective mechanisms of neurotrophin-3 (NT-3)on spinal cord injury.［Method］using the method of Allen's (WD) to make the animal model of acute spinal cord injury of rats, 105 SD rats were randomly divided into three groups: control group, experimental group and sham group. A thin plastic tube was situated in subarachnoid space below the injury level for perfusion. Rats in experimental group received NT-3 20μl(including NT-3 200ng) from the tube at 0, 4, 8, 12, 24h and 3d, 7d after injury; the saline-treated animals received the equal volume of normal saline at the same time as control. The animals in sham group only received opening vertebral plate and putting tube in subarachnoid space. The rats were sacrificed at 4,8,12,24h and 3, 7, 14d postinjury (n=5). The expression levels of Fas protein in rats spinal cord were detected by immunohistochemistry assay. ［Result］The levels of Fas protein in control group were significantly increased as compared with those in sham group, and the level reached peak at 24h after spinal cord injury. The levels of Fas protein in NT-3 group were significantly decreased as compared with those in control group.［Conclusion］NT-3 can protect spinal cord from injury in vivo. One of mechanisms is that inhibits abnormal expression of Fas protein,then inhibits apoptosis after spinal cord injury.
Key words：Neurotrophin3;Spinal cord injury; Fas
程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)亦称凋亡(apoptosis)是一种的生理过程，在维持细胞和脊髓发育以及排除异常细胞过程中起关键作用。近年来凋亡在脊髓继发性损伤中越来越受到重视。神经营养素3(NT3)对脊髓损伤有很好的保护作用，已有实验证实NT3能抑制脊髓损伤后脊髓损伤区的细胞凋亡，由于目前对Bax／Bcl2研究较多，而对Fas研究相对较少，因此本实验旨在通过观察NT3对Fas蛋白表达的影响，进一步探讨NT3抑制脊髓损伤后神经细胞凋亡的机制。
1 材料与方法
1．1 材料与仪器
兔抗鼠Fas多克隆抗体(一抗)，SABC试剂盒及DAB显色试剂盒(均购自武汉博士德公司)。NT3(CYTOLAB公司)，SD大鼠(第三军医大学大坪实验动物中心)。
1．2 动物与分组
健康成年SD大鼠105只，体重220～270g，雌雄不拘，分为3组：（1）NT-3组(实验组)35只，经蛛网膜下腔分别在术后即刻、4、8、12、24h、3、7d给予NT-3溶液20μl(含NT-3 200ng)；（2）生理盐水组(对照组)35只，在相同时间内注入等容积生理盐水；（3）假手术组35只，只打开椎板，蛛网膜下腔置管，不造成损伤。
1．3 动物模型
20％乌拉坦(1000mg／kg)腹腔麻醉，以T8为中心，取背部正中切口，显露T7～12棘突及椎板，文氏钳咬除T7～10棘突，咬除T8全椎板，以脊髓为中心显露直径约3mm圆形区。再咬除T10右侧半椎板，暴露硬脊膜，作为蛛网膜下腔置管区。将薄铜片(约2mm×3mm)弯成弧形与脊髓表面形状一致，以6g×5cm致伤力造成大鼠T8脊髓损伤模型。大鼠尾巴痉挛性摆动，双下肢及躯体回缩扑动后双下肢瘫痪，为造模成功标志。造模成功后，用显微镊轻提T10处硬膜，偏离后正中血管在硬脊膜上用1ml注射器针头制孔，缓慢向脊髓损伤方向于蛛网膜下腔插入细导管(内径约0．1mm)约3mm，并固定于椎旁软组织及皮肤，手术组和对照组分别在术后即刻、4、8、12、24h、3、7d给予NT-3溶液20μl或等容积生理盐水，假手术组，只打开椎板不造成损伤，插入导管后固定缝合，不给予任何处理。术后分笼饲养，2次/d肌注青霉素，术后前3d每隔8h按摩膀胱排尿。
1．4 脊髓神经功能评价
采用脊髓运动功能(BBB)评分观察脊髓神经功能恢复情况。分别对术后24h、3、7、14d大鼠进行评分，根据大鼠昼伏夜出习性，评分均在晚上8：00进行。定量评价脊髓损伤后的运动功能。
1．5 取材及切片
动物在各时间点麻醉，经左心室-主动脉插管灌流后，取出完整脊髓组织。切取损伤段脊髓组织，长约5mm。石蜡包埋后，连续切片，片厚6μm。每个组织块随机取连续切片2张，分别做HE染色及免疫组化分析。
1．6 免疫组化
石蜡切片常规脱蜡至水，免疫组化操作过程按试剂盒说明书进行,DAB显色，镜下控制，蒸馏水清洗终止显色，苏木素轻度复染，梯度脱水，透明，中性树胶封片，进行对照观察。应用Image-pro-plus生物医学图像分析系统，在40×10倍镜下对结果进行半定量的分析，平均光密度值(AOD值)。
1.7 统计学处理
所有数据采用spss10．0软件包处理，以均数±标准差(±s)表示，组间差异采用独立样本t检验。P<0．05为差异有显著性,P<0．01为差异非常显著。
2 结果
2．1 BBB评分结果
BBB评分结果(表1)显示实验组与对照组在运动功能恢复上有显著性差异(P<0．01)，实验组明显优于对照组，表明NT-3能明显促进大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复。表1 大鼠脊髓损伤BBB评分变化实验（略）
2．2 HE染色结果
对照组：术后4h损伤节段灰质内可见散在的多处出血灶并可见较多神经元细胞核固缩，浓染，整个胞体及胞膜皱缩，包膜完整，呈现典型凋亡细胞形态；术后8h灰质内出血灶明显增多，术后24h凋亡细胞数达高峰，术后3d可见坏死细胞碎片组织，并可见胶质细胞增生，术后1w损伤部位有较多增生的胶质细胞，损伤段脊髓变细，可坏死空腔，术后14d脊髓组织变得疏松，可见大量胶质细胞增生及空洞形成。实验组细胞凋亡数及空洞形成均明显轻于对照组。在假损伤组只见少量凋亡细胞。
2．3 免疫组化结果
对照组：假手术组Fas抗原免疫反应弱阳性表达，对照组：4h即出现阳性表达(图1)，24h达高峰(图3)，此后表达逐渐减弱，实验组：4h也出现阳性表达(图2)，24h达高峰(图4)，但与对照组有显著性差异(P<0．01)(表2)表2 大鼠脊髓损伤后Fas平均光密度（略）
3 讨论
细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是一种主动死亡方式，在生理状态有三种主要机能：淘汰机体反应差、受损伤后不能恢复的细胞;平衡机体过度增生的各类细胞(如：炎性细胞);另外凋亡细胞不发生破裂，被吞噬细胞吞噬后不引起炎性反应，与坏死细胞被吞噬过程完全不同，故可有效限制炎症保护机体。但是在严重损伤时，细胞内外环境发生极度紊乱，细胞凋亡出现严重异常，可引起凋亡过快或延迟、凋亡比例过多或清除障碍，进而产生机体组织继发性损伤改变［1］。研究脊髓损伤后神经细胞凋亡可以认识继发性损伤机制，了解脊髓损伤后自毁过程，分析影响细胞凋亡因素，探索抑制影响因素的各种方法，改善、预防脊髓组织继发性不良变化［２］。
线粒体途径和死亡受体途径是细胞凋亡的两个基本途径，Fas又称APO-1，即CD95,是细胞死亡受体途径最重要的调节物质之一，它一旦于其配体结合，将会诱发细胞凋亡［3］。Fas与其配体FasL结合后，形成同源三聚体，通过与其效应分子Fas相关蛋白(Fas-associating protein with death domain，FADD)结合，形成死亡信号复合体，激活caspase-8，caspase-8激活后作用于caspase-3，后者引起染色体降解，细胞凋亡。Sakurai等［4］发现，兔短暂脊髓缺血后运动神经元凋亡细胞的Fas抗原在8h～1d表达，推测Fas可能参与脊髓缺血后运动神经元凋亡的信号活动。
本实验研究表明脊髓损伤后4h，灰质区已出现Fas蛋白表达，伤后24h阳性细胞数量达高峰，3d时明显减少，14d已呈弱阳性神经元表达。实验组4h可见Fas蛋白表达，伤后24h阳性细胞数量达高峰，但与对照组有显著性差异(P<0．01)，假手术组只见少量弱阳性细胞表达，24h已基本消失。本实验显示Fas在伤后24h达高峰，与刘世清等［5］报道细胞凋亡在伤后24h达高峰一致。在整个实验过程中，凋亡细胞主要集中于灰质前角神经元，后角及白质的阳性细胞数均不多，其原因可能与脊髓损伤程度及血供有关。孔抗美等［6］研究发现中度压迫组比重度压迫组和轻度压迫组的凋亡率高。当打击作用于脊髓背侧时，感觉信息的传导障碍可以在很大程度上抑制运动信号的传导，造成后柱区域的外伤性冲力可以引起脊髓前部同样甚至更严重的损伤，同时损伤后灰质区血流供应相对较差，因此损伤较白质及后角要重，阳性细胞相对较多。同时本实验BBB评分也表明NT-3能明显促进大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复，那么，通过抑制Fas蛋白的表达来抑制细胞凋亡可能是NT-3对脊髓保护作用的机制之一。
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［1］Thompson CB．Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease［J］．Science,1995,267：1456-1462．
［2］Crowe MJ，Bresnahan JC，Shuman SL，et al．Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys［J］．Nature Medicine,1997,3：73-76．
［3］Rafff M．Cell suicide for beginners［J］．Nature,1998，396(6707)：119-122．
［4］Sakurai M，Hayashi T，Abe K，et al．Delayed selective motor neuron death and Fas an tigen in duction after spinal cord ischemia in rabbits［J］．Brain Res,1998,797：23-28．
［5］刘世清，周华，彭昊，等．大鼠急性脊髓损伤后细胞凋亡的时空分布特点［J］．矫形外科杂志，2003，11（24）：1699-1700.
［6］孔抗美，齐伟力，周强.慢性压迫性脊髓损伤细胞凋亡的实验研究［J］.中华创伤杂志，2001，17（3）：158-160.
