基因治疗促进脊柱融合的研究进展
作者：董智勇 邝冠明 郑召民
【关键词】 ,下腰痛
下腰痛(low back pain)给患者和社会带来了沉重的负担，据统计，70％~90％的人一生中会经受腰背痛的折磨，其中10%~20％会为慢性下腰痛。脊柱融合术至今仍是对经保守无效的下腰痛患者所采取的一种标准治疗方法。近年来因椎间盘退变性疾病、腰椎不稳等原因接受脊柱融合手术的患者逐年增加，随着此类手术的广泛开展，其存在的问题也逐渐引起了人们的重视。其中最主要的是假关节发生率高、临床疗效不佳〔1〕。为了解决这些问题，人们从脊柱融合的生物学和生物力学等多方面进行了尝试，包括内固定器械的广泛应用及融合技术的改进等，Bono等对过去20年发表的综合分析，结果表明所有上述技术改进对融合率和临床疗效均无显著影响〔2〕。这些研究结果促使人们寻找新的研究方向，提高融合率。随后研究的重点逐渐集中在通过生物学方法改进骨移植材料方面。
基因工程和组织工程的发展为解决这一难题带来了希望。大多数研究者认为选择合适的骨生长因子基因、病毒载体、合适的组织工程种子细胞以及支架材料十分重要，相关的研究也多是围绕这些方面展开，并且取得了很多研究成果。
1 骨生长因子及病毒载体
能够促进骨愈合及脊柱融合的生长因子很多，目前人们研究的主要有以下几种：转化生长因子β(TGFβ)、成纤维细胞生长因子(FGH)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)以及骨形态形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)等，由于上述生长因子均在骨愈合的不同阶段分泌，人们普遍认为这些因子具有潜在的促进骨愈合的能力，逐渐引起了研究者的重视〔3〕。TGFβ超家族成员BMPs已被证实能在骨愈合过程中诱导未分化的间质细胞增殖、分化，诱导骨再生，促进骨愈合；并且在细胞生长及骨形成过程中扮演关键的角色，因而一直处于研究的重点。在已发现的20余种BMPs中，BMP2、BMP4、BMP7(OP1)的骨诱导能力最强。它们形成软骨和新生骨，在促进成骨及脊柱融合的实验和临床研究中已取得了成功的经验。然而，由于BMP的释放速度与新骨生长速度不匹配，单纯应用BMP的效果尚未理想，因此，应有合适的载体来调节BMP的释放速度。应用基因工程技术将BMP基因重组入宿主细胞基因组中，使BMP获得持续的表达是这一领域中重要的突破方向，研究者正致力于寻找合适的基因工程方法使其在临床骨科疾病的治疗中发挥作用，这一领域的研究进展极大地促进了脊柱融合的研究。
目前有以下几种研究方向：一个研究方向是用原核表达系统进行表达。由于原核细胞内无蛋白质剪切加工系统和糖基化系统，因此BMPs表达产物以包涵体形式存在于细胞浆内，而不能分泌出胞。依据原核细胞的非分泌性表达来获得高产量、高活性的BMPs至今仍有技术难度。第二个研究方向是在真核细胞中进行BMPs的表达。由于真核细胞表达系统培养条件要求严格，分泌型蛋白表达水平低，因此生产成本高，不利于进行大规模生产，限制了从实验研究走向临床应用的发展。第三个研究方向是采用病毒重组技术获得BMPs的持续表达。
病毒重组技术是目前研究的重点和热点。逆转录病毒介导的基因转移技术在欧美已用于某些遗传性疾病和骨外疾病的基因治疗〔4〕。但它只整合入增殖期的靶细胞，插入突变的可能性较大，限制了其进一步应用。腺病毒载体具有较大的宿主范围，目前在基因治疗的研究中较多〔5〕。但重组腺病毒仅存在于细胞浆中而不能整合入靶细胞染色体，外源基因只能瞬时表达；而且它存在免疫原性以及野生型病毒污染的可能，安全性值得注意。这促使人们寻找其它更适合BMPs表达的病毒载体。在这种情况下，腺相关病毒(adeno associated virosis，AAV)和慢病毒逐渐引起了人们的重视。人们研究发现AAV几乎可以感染所有已建立的体外细胞系，且野生型AAV对人类无致病性。AAV基因组可以整合入宿主细胞的基因组DNA中，保证了外源基因长期稳定表达；AAV末端重复序列中的转录元件方向不指向宿主DNA，插入突变的可能性很小；该病毒载体可整合入分裂及非分裂期细胞，宿主范围较宽〔6〕。Chen等对AAV在骨组织工程中的应用进行了很多有益的尝试，他首先发现AAVBMP2可以高效转染C2C12细胞，促进成骨，具有极好的应用前景〔7〕，随后他联合应用AAV及腺病毒表达BMP2基因，发现两者均可明显的促进成骨，且具有较好的协同作用，Ad可以促进AAV介导的BMP2的表达〔8〕。在此基础上，Chen等进行了更深入的研究，采用不同的目的基因――BMP4，构建AAVBMP4转染小鼠C2C12细胞，观察到明显的促进成骨作用〔9〕。
2 种子细胞
种子细胞是组织工程学中的最重要、最基本的环节。作为骨组织工程学理想的种子细胞，应该具有以下特点：结构简单；取材容易，对机体损伤小；体外培养时增殖力强；自我更新，一定的条件下能向特定的方向分化；稳定表达成骨细胞表型；植入体内后能继续产生成骨活动；无致瘤性。建立一个能够持续、稳定表达目的基因的细胞系是组织工程骨治疗的关键。
人们对于自体骨组织及骨膜来源的骨髓细胞、成骨细胞研究的最早，其取材和培养方法也较为成熟，但取材困难、来源有限、易老化，限制了进一步应用。干细胞具有多向分化性，控制培养体系可向成骨细胞分化，是目前研究的热点。干细胞分为组织干细胞和胚胎干细胞；胚胎干细胞虽然具有很多优势。但面临很多伦理性及安全性问题，如致瘤性问题尚未解决；相对而言，组织干细胞可能是近期应用的最佳种子细胞来源〔10〕。其中研究最多的是骨髓间充质干细胞(BMSCs)和肌源性干细胞(MDSCs)。
BMSC是广泛存在于骨髓间质内的未分化间质干细胞，具有取材方便、易培养和多分化潜能等优点，曾被认为是一种理想的组织工程种子细胞。Riew等用腺病毒载体携带BMP2基因转染新西兰兔BMSC，与明胶海绵复合，植入兔L5~6横突间。术后2周，组织学检查即可见新骨形成；术后7周，横突间有明显的成熟骨小梁，而对照组则无新生骨形成〔11〕。
但是随着相关研究的深入，人们发现了BMSC存在的问题――基因转染效率较低，不利于BMP基因长期高效表达。人们开始致力于寻找一种更优的靶细胞，高效表达BMP类基因。肌源性细胞(MDCs)引起了研究者的关注,He等研究发现腺病毒介导的BMP2、4、6、7、9等基因可以高效转染成肌细胞系C2C12细胞，明显表达碱性磷酸酶(ALP)的活性，BMP5、8、10、11、12、13亦可引起C2C12细胞ALP的活性升高；而在多能性间充质祖细胞中，仅有BMP2、7、9可以诱导出明显的ALP活性，BMP4、7的作用较弱，其它则无此类作用〔2〕。Chen的研究也支持这一结论〔8~9〕。Rose等进一步比较了MDC和BMSC在转染BMP4基因诱导成骨中的作用。研究者分别应用逆转录病毒转染小鼠MDC和BMSC，用以表达BMP4，2组细胞分别植入鼠股骨骨缺损模型处，观察成骨情况，术后8周和12周2组均可观察到骨桥形成，但MDCBMP4组密度显著高于BMSCBMP4组，前者无骨不连发生(本组14只)，而后者发生骨不连者为6只(本组17只)；研究者认为MDC在骨缺损的治疗中要明显优于BMSC〔13〕。Wright等研究发现，包含BMP4基因的逆转录病毒可以高效转染MDSC，分泌高水平的功能性BMP4因子，在免疫活性小鼠的实验中，异体移植的MDSCs也可以诱导健康的新生骨形成，作者认为基于MDSCs的基因治疗技术在促进骨愈合上极具潜力〔14〕。Shen等比较了MDCs不同的亚群在诱导成骨中的作用，他们发现PP6中的MDSCs作用最强，为骨组织工程的发展寻找一种更加理想的靶细胞提供了可能〔15〕。MDSCs在骨组织工程中的作用，逐渐得到了人们的认同，对其研究得到了越来越多的重视〔16~20〕。
3 生物支架材料
骨组织工程中理想的生物支架材料应满足以下特点：具有良好的生物相溶性和生物降解性，具有骨传导性和骨诱导性，具有一定的生物力学强度和刚度。目前应用的生物支架材料种类很多，主要包括天然高分子材料和人工合成高分子材料两大类，各具优缺点。前者中常用的有脱钙骨基质(DBM)、胶原等，具有生物相溶性和生物降解性优良、利于细胞黏附生长、骨诱导性好等特点，是应用最广泛的生物支架，但是其生物强度较低，具有一定的免疫原性，限制了其进一步应用。后者常用的有PGA、PLA、PLGA、羟基磷灰石、磷酸三钙陶瓷等，这类材料普遍存在生物降解与组织形成速度不匹配，骨诱导性不佳等缺点，并非理想的生物载体。人们为了寻找一种理想的生物支架材料，进行了大量的研究。Martin等进行的一项研究，分别采用不同剂量的rhBMP2与不同载体复合，植入29只恒河猴L4~5横突间融合模型中。研究者发现在标准的BMP2作用剂量下，由于胶原海绵载体被压缩，从而阻碍了骨诱导，作者推测可能是由于组织间的挤压作用，BMP2被挤出了海绵载体；如果在胶原复合rhBMP2时，填充的时间足够长、对组织压缩采取了相应的机械保护，即使较低剂量的rhBMP2亦可以有效地促进骨诱导〔21〕。Usas等则通过比较4种不同的支架载体研究发现，一种新型的支架材料Gelfoam和胶原作为成骨性细胞的载体效率最高，且两者骨矿化成形作用模式相似，而Gelfoam克服了胶原存在的部分缺陷，是一种较为理想的支架材料，研究者结合异位成骨的相关研究结果认为Gelfoam是骨诱导支架的“金标准”〔22〕。
4 基因治疗在脊柱融合中的作用
近年来，大量的研究证实了基因治疗促进脊柱融合的可行性。目前，多数学者采用BMP家族基因中的BMP2、BMP7进行促进脊柱融合的实验研究。Wang等用AdBMP2转染骨髓基质细胞，植入兔L4、5横突间，在所有应用BMP2组，术后4周均良好融合，组织学观察均可发现骨小梁形成，在未采用BMP2的所有对照组，仅有少量新生骨或者无新生骨形成；作者认为基因治疗的方法可以有效促进脊柱融合〔23〕。Jenis等研究表明BMP7(OP1)在脊柱融合早期可以促进成骨〔24〕。Sandhu等也认为BMP2、BMP7可以有效促进脊柱融合。新近的研究证实rhBMP4促进脊柱融合的作用强于rhBMP2，所需剂量仅为rhBMP2的十分之一，且成骨量与剂量成正相关，为BMP4在脊柱融合方面的应用提供了理论和实验基础。Guo等通过大鼠的脊柱融合动物模型证明，BMP4能促进非骨髓源性间充质干细胞分化成为成骨性细胞，进而促进局部成骨，提高脊柱后外侧融合的融合率〔25〕。李广恒等应用包含BMP4基因的腺病毒载体，转染兔BMSCs，高效表达BMP4因子，并植入兔横突间，有效促进了脊柱融合〔26〕。
5 结论与展望
如何有效地促进脊柱融合，提高融合率和临床疗效，减少并发症，一直是脊柱外科医生难以解决的难题。基因和组织工程的为解决这一难题带来了希望。人们对此进行了大量的研究，取得了一系列研究成果。通过基因治疗和组织工程方法构建的骨移植替代材料在动物实验中已经取得了良好的疗效，可以在脊柱融合部位长期高效稳定表达骨生长因子，有效地促进脊柱融合；Boden等在灵长类动物实验的基础上，已经成功地将NeOsteo及rhBMP2等因子应用于人体的临床实验，报告了极佳的临床疗效〔27〕。这些研究成果必将极大的促进相关研究的继续深入，为组织工程骨早日进入临床奠定了理论和实验研究的基础。
但是作者也注意到了目前存在大量尚待解决的问题。基因治疗的研究仍然停留在较低等动物的水平上，缺乏高等动物的相关研究，对于灵长类动物的研究目前还未见到基因水平上的报道；由于物种进化的复杂性和多样性，在低等动物身上证实有效的骨移植物并非一定能成功应用于较高级的动物，人们还需要应用灵长类实验动物来检验其功效。基因治疗的安全性还未得到有效验证，人们对其尚存很多争议；在其作用的有效剂量、效费比等相关问题上仍存在着较大分歧。目前在病毒载体、种子细胞、生物支架材料等各个方面，研究者尚未取得共识：病毒载体的安全性问题有待于进一步解决；如何寻找一种能够高效转染并且长期稳定表达目的基因的靶细胞也是研究者关注的热点问题；而研究中应用的生物支架载体均存在某些缺陷，目前尚无一种具有良好的生物相溶性和生物降解性、具有骨传导性和骨诱导性以及良好的生物力学强度和刚度的载体材料。上述这些问题限制了基因治疗和骨组织工程在脊柱融合中的进一步应用，人们必须进行长期艰苦的探索才能有效的解决这些问题。
尽管基因治疗还存在着很多问题，但其研究的兴起仍为脊柱融合的研究提供了一种全新的思路。人们有理由相信，随着相关研究的逐渐深入，人们一定会解决这些问题，为基因治疗在促进脊柱融合中的应用奠定良好的基础。
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