免疫磁珠法分离和提纯雪旺细胞的实验研究

                 作者：黄明 罗卓荆 肖伟 张强

【摘要】  ［目的］探讨利用免疫磁珠从SD大鼠坐骨神经分离培养获得大量、高纯度雪旺细胞的方法。［方法］选用4～7 d SD大鼠，无菌条件下取双侧坐骨神经，解剖镜下剥离去除神经外膜，获得神经束，将神经束剪碎至1 mm3大小。采用双酶2次消化法消化，胎牛血清中止消化后，离心并加入DF12培养液培养。7 d后应用免疫磁珠法对细胞进行纯化培养，培养2 d后进行传代接种。培养过程中对细胞进行形态学观察、计数及活力测定；MTT法绘制细胞生长曲线，采用免疫细胞化学荧光染色对细胞进行鉴定并且所得细胞纯度。［结果］分离培养所得细胞即为雪旺细胞；采用免疫磁珠法能对培养所得雪旺细胞进行纯化。纯化后雪旺细胞活力为96%±0.5％，纯度98%±1.1%，培养2 d后就可以传代。［结论］免疫磁珠法可以用于雪旺细胞的纯化培养，所得雪旺细胞纯度高，活力强，能满足组织工程人工神经的需要。

【关键词】  雪旺细胞； 免疫磁珠； 坐骨神经

    Abstract：［Objective］To introduce a method to obtain Schwann cells from newly born SD rats massively and purely by immunomagnetic heads method.［Method］SD rats that had been born within 5 to 7 days were used. Their bilateral sciatic nerves were dissected under sterile condition. Under 16×microscope the nerve fascicles and the epineurium were carefully extracted in oder to get the nerve tract without impurity cell. Then the nerve tract was cut  into small particle about 1 mm3.Two enzymes (0.25% trypsinase and 0.2% collagenaseⅠ)were used to digest the particle of sciatic nerve specimens twice. After using 20% fetal bovine serum to stop the process of digestion,centrifugate(1000r/min,5 min) and DF12 culture medium was added into the precipitation.Seven days later,Schwann cells were purified with immunomagnetic heads.During the whole process,the change of Schwann cells was observed under the  inverted biological microscop and vital force of Schwann cells was evaluated.The growth curve of Schwann cell was drawn with MTT.The Schwann cells was identicated under immunofluorescent test and record the purity.［Result］The cell separated from the SD rat's sciatic nerve and cultured in incubator was affirmed as Schwann cells.Immunomagnetic heads can be used to purify the Schwann cells.The 96% vigor and 98% pure Schwann cell cultures were generated and passaged after two days.［Conclusion］This method can obtain massive purified normal schwann cells to satisfy the need of tissue?engineered bioartificial nerve graft.

    Key words：Schwann cell;  immunomagnetic heads;  sciatic nerve

     雪旺细胞（Schwann cell，SC）是周围神经系统的主要胶质细胞，包绕周围神经的轴突，形成髓鞘［1］。现已证明周围神经的再生能力主要归功于雪旺细胞，它能分泌少量神经营养因子促进神经轴突的发芽再生；其分泌的细胞外基质能够形成类髓鞘的管状结构，为再生轴突的延伸和生长提供隧道［2］。雪旺细胞可以起到神经轴突的“导管”、“导向”作用。所以目前认为雪旺细胞在周围神经损伤修复及神经组织工程中有良好的应用前景；但如何快速获取大量高纯度、高活性雪旺细胞是移植的关键。雪旺细胞培养的组织来源多为周围神经和背根神经节组织［3］，为获得高纯度的细胞，培养的关键在于去除沾染的成纤维细胞［4、5］，同时保持雪旺细胞较长时间的生存增殖能力。雪旺细胞培养的方法主要有：组织块培养法、单酶消化法及双酶消化法等。对于各种方法的优劣，报道不一。为此，本实验希望尝试通过免疫磁珠来培养及纯化雪旺细胞，为神经组织工程进一步研究打下基础。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    实验动物  4～7 d的SD仔鼠 3～5只,雄性。 由第四军医大学动物研究所提供。

    培养液  DF12培养液（Gibco）、胎牛血清（Gibco）。

    主要试剂  免疫磁珠（标记羊抗鼠IgG、Minmaagnetic cell sorting，德诺DYNA公司)，细胞磁性分离器（德诺DYNA公司）。Mouse Anti?p75LNGFr（武汉博士德）。SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德）。MTT（Gibco）。DMSO(Gibco)。

    消化用酶  0.25％的胰蛋白酶（Sigma）和0.2％的Ⅰ型胶原酶（Gibco）。

    仪器  倒置相差显微镜（NIKON,TE2000?E）,解剖镜，酶联免疫检测仪（蒙雷，芬兰）。

    1.2  细胞分离

    脱颈法处死仔鼠，75％酒精浸泡消毒10 min，D?hanks′液冲洗。切开股骨干后外侧皮肤，更换器械后，取双侧坐骨神经（长约1 cm），置于已加入D?hanks′液的培养皿中。16倍解剖镜下剥除神经外膜，分离得到神经束。D?hanks′液漂洗3次，每次0.5 min。剪成1 mm3左右的碎块，用吸管将其移至离心管中。加入0.25％的胰蛋白酶和1 ml 0.2％ 的Ⅰ型胶原酶,37℃混合消化约30～40 min，吸弃上清液，再加入0.2％的Ⅰ型胶原酶4 ml，37℃消化约50～60 min，消化过程中每隔20 min振荡消化液一次以利于消化。消化结束后，利用火焰抛光的玻璃吸管小心进行机械吹打，直至溶液呈混悬状，无明显肉眼可见组织。1 000 r/min离心5 min，吸弃上清并加入DF12培养液4 ml（含体积分数为20％胎牛血清）终止消化，再次1 000 r/min离心5 min，吸弃上清，加入DF12培养液4 ml(含体积分数为20％的胎牛血清)吹打混匀，计数后将浓度为2×105/ml的细胞悬液接种于塑料细胞培养瓶，置体积分数为5％的CO2孵箱中37℃培养。培养过程中每24 h观察细胞形态及生长情况。

    1.3  细胞纯化

    细胞接种后第7～10 d，吸弃培养液，加入0.25％的胰蛋白酶消化，制成细胞悬液4 ml，而后加入Mouse Anti?p75LNGFr 100 μl，37℃培养，10 min后加入200 μl免疫磁珠（标记羊抗鼠IgG），37℃培养15 min后，置于磁性分离器上，吸去上清，加入DF12培养液5 ml (含体积分数为20％的胎牛血清)， 5％CO2 37℃培养24 h后,再置于磁性分离器上，分析上清。目的细胞在上清液中，移至培养瓶中继续培养，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。培养2 d后即可进行传代。吸弃培养液，PBS液清洗1次，0.25％的胰蛋白酶室温（24℃）消化，约30 s后可见细胞突起收缩，胞体变圆，立即加入DF12培养液4 ml(含体积分数为20％的胎牛血清)终止消化。1000 r/min离心5min，吸弃上清，加入DF12培养液4 ml(含体积分数为20％的胎牛血清)吹打混匀，计数后按3～5×105/ml的细胞浓度传代。

    1.4  细胞计数

    细胞生长过程中每24 h显微镜下观察细胞的生长情况。在细胞接种及传代前均进行活细胞计数。计数方法：取待测细胞悬液0.1 ml，加入D?hanks′液0.8 ml，0.3％台盼蓝0.1 ml， 混匀后滴入血球计数板内，按白细胞计数法，于低倍镜下计数4角的4个大方格内的活细胞(透明未着色)总数。计数过程中，对大方格的边缘压线细胞应按数上不数下，数左不数右的原则进行计数。计数时，2次重复计算误差不应超过10％。

    1.5  MTT法绘制雪旺细胞生长曲线

    计算倍增时间：取两组传代雪旺细胞悬液，调整细胞浓度为1×104/ml，接种于96孔培养板，每块板每组取8孔，200 μl/孔，共接种9个样本。37℃，5％CO2培养3 d。培养3 d后，每日固定时间取板1块，加5 mg/mL MTT试剂20 μl/孔，37℃，5％CO2孵育箱中4 h；弃上清，加DMSO 150 μl/孔，振荡10 min，酶联免疫检测仪测吸光度值(A值/OD值) ，激发波长：490 nm，计算当日各组A值均数，以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制生长曲线。倍增时间计算：DT=t×lg2/lg(Nt/N。)(DT为A值增加1倍的时间， Nt为t时问的相对A值，N。为培养第1 d的相对A值)。

    1.6  细胞鉴定

    取对数生长期细胞，0.25％胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，将细胞接种到预置盖玻片的24孔板中， 5％CO2 37℃培养1～3 d，至细胞长成单层时，取出盖玻片，浸入PBS漂洗2次， 4％多聚甲醛固定60 min。取出固定的细胞片，用PBS洗5 min，浸入0.75％H2O2?PBS（30％H2O2 5ml＋PBS 200 ml）37℃,30 min。PBS振洗2次，每次3 min。加入Rabbit Anti?S100 (1∶100，1抗)， 4℃过夜。PBS洗3次，每次2 min。加入生物素化羊抗兔IgG(2抗)，37℃,20 min。PBS洗3次，每次2 min。水浴30 min后加入ABC复合剂着色(ABC法)。此外加入荧光素标记IgG可以行免疫荧光染色。显微镜下观察并照相。

    1.7  细胞纯度

    将纯化的雪旺细胞进行消化，取1滴细胞悬液滴于盖玻片上，37℃温箱中培养24 h后取出，采用间接免疫荧光法或ABC法进行鉴定。

    纯度计算法：随机选取10个高倍镜（10×20）下不同视野，间接荧光法以普通光下见到的细胞数为细胞总数，以荧光激发后镜下发荧光的亮绿色的细胞为阳性细胞：ABC法以蓝色细胞核数为总细胞数，以胞浆显色者为阳性细胞数。

    阳性细胞数／总细胞数×100＝阳性细胞百分数，亦即雪旺的纯度。

    2  结  果

    2.1  雪旺细胞的形态学鉴定

    采用胰蛋白酶和胶原蛋白酶混和消化后细胞存活率为96.4%±2.1％，细胞在接种1～2 d后可观察到少量雪旺细胞贴壁，胞体以梭形为主，少数为三角形，部分细胞已伸出双极突起，细胞核为圆形或卵圆形。3～5 d后，出现聚合现象，呈旋涡状或栅栏状排列生长。随着培养时间的延长，突起更加细长，细胞间排列更紧密，形成状。雪旺细胞和成纤维细胞成双层生长，雪旺细胞多数呈梭形，少数呈三角形或不规则形，胞体较小，具有两个细长的突起。成纤维细胞的胞体较大，扁平，呈不规则形，无细长突起，覆盖于瓶底，雪旺细胞在其上生长。7 d后成纤维细胞的数量逐渐增多，因其生长速度快，很快即铺满瓶底，雪旺细胞则随后生长于其上。经免疫磁珠提纯的雪旺细胞多为胞体较小、具有两个极状突起的梭形细胞，少数为三角形或不规则形。纯化培养2 d后，雪旺细胞活力96%±0.5％，纯度98%±1.1％，增殖良好。

    2.2  雪旺细胞鉴定

    将纯化的雪旺细胞接种于盖玻片后，对其进行S?100免疫细胞化学染色，可见大量S?100阳性细胞(图1、2)。由S?100阳性细胞计数得出雪旺细胞纯度：98±1.1％。

    2.3  雪旺细胞增殖能力测试

    用测得的MTT吸光度值(A值／OD值)绘制细胞生长曲线。结果显示培养2～7 d的2代雪旺细胞处于对数生长期(图3)。倍增时间为3 d。

    图1  S?100蛋白染色  ×20

    图2  免疫荧光染色  ×20

    图3  雪旺氏细胞生长曲线

    3  讨  论

    雪旺细胞是外周神经的神经胶质细胞，在神经系统的发生、发育，特别是神经再生中起着重要作用。随着神经组织工程的，需要获得大量高纯度的雪旺细胞，目前主要的培养方法有组织块培养法、单酶消化法、双酶消化法、特异粘附法等［6～9］。但这些方法均有获得细胞纯度低、数量少、不易长期存活等问题。

    本试验采用0.25％胰蛋白酶加0.2％Ⅰ型胶原酶二次消化法，消化1 h后神经束基本消化完全，活细胞率可达94.6±3.4％［10］。本方法使用较低浓度的胰蛋白酶进行消化，减少了对雪旺细胞的损伤，消化过程简单，取得了较好的效果。

    要获得高纯度的雪旺细胞，去除成纤维细胞的污染是关键。剥离神经外膜可大大减少成纤维细胞数量，但神经束膜及内膜中仍含有部分成纤维细胞，培养时增殖迅速。严重影响雪旺细胞的纯度。目前多采用阿糖胞苷、G?418等抗有丝分裂、特异性粘附以及免疫选择等方法来去除成纤维细胞［5、11、12］。但这些方法去除成纤维细胞不彻底，且对雪旺细胞有一定毒性；剂量较小则成纤维细胞不易去除、剂量稍大易致雪旺细胞死亡或严重影响其活力。本实验Vroemen M等［13］纯化雪旺细胞的方法，同时选用直径约200 nm磁珠，既避免了小磁珠（50 nm）需要强磁场来分离细胞、分离速度慢、获得率不高、需要一次性分离柱、不能在普通试管进行且成本昂贵的缺点，又避免了大磁珠（1 200～4 500 nm）对细胞造成机械压迫、影响其生物学活性、不利于分离后培养、纯度低的缺点。成功得到纯度>98％的雪旺细胞，且细胞活性良好。同传统去除成纤维细胞的方法相比，具有去除成纤维细胞彻底、对雪旺细胞损伤小、容易掌握和控制等优点。

    随着组织工程材料移植修复周围神经损伤研究的不断深入，移植用种子细胞的来源倍受关注，使用改良的免疫磁珠法可简单、快捷地获得纯度高、活力强的大量雪旺细胞，适合实验室推广应用，能满足组织工程人工神经的需要。

【参考】
  ［1］ 王建云，刘小林.雪旺细胞的培养和种植与神经移植［J］.矫形外科杂志，2001，6：590-592.

［2］ Honkanen H,Lahti O,Nissinen M，et al.Isolation,purification and expansion of myelination?competent,neonatal mouse Schwann cells［J］.Eur J Neurosci,2007,4:953-964.

［3］ Hadlock TA，Sundback CA，Hunter DA，et al.A new artificial nerve graft containing rolled Schwann cell monolayers［J］.Microsurgery，2001，3:96-101．

［4］ Buchstaller J,Sommer L,Bodmer M,et al.Efficient isolation and gene expression profiling of small numbers of neural crest stem cells and developing Schwann cells［J］.J Neurosci,2004,10:2357-2365.

［5］ Mauritz C,Grothe C,Haastert K.Comparative study of cell culture and purification methods to obtain highly enriched cultures of proliferating adult rat Schwann cells［J］.J Neurosci Res,2004,3:453-461.

［6］ 张勇杰，会 岩，聂 鑫，等．雪旺细胞三维培养体系的构建［J］．牙体牙髓牙周病学杂志，2002，12:642．

　　［7］ 潘良春，尹宗生.新生和成年大鼠雪旺细胞培养纯化的实验研究［J］．中国康复医学杂志,2005,11:817．

［8］ Pannunzio ME，Jou IM，Long A．A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve［J］．J Neurosci Methods，2005，1：74-81．

［9］ Calderon?Martinez D，Garavito Z，Spinel C，et al．Schwann cell?enriched cultures from adult human peripheral nerve：a technique combining short enzymatic dissociation and treatment with cytosine arabinoside(Ara?C)［J］．J Neuresci Methods，2002，1：1-8.

［10］黄小强，罗卓荆，李明全．新生SD大鼠坐骨神经雪旺细胞培养与纯化的方法学研究［J］．中华创伤骨科杂志，2005，4：341-343．

［11］Li WP，Zhu JK．Studies of activity of Schwann cells on the nervous scafold in vitro［J］．Chin J Microsurg，2002，1：31-33.

［12］Hu Xt，Chen XX，Xiong LJ，et al．Studies of proliferation of rat Schwann cells using Ginsenoside Rbl［J］．Chin J Repara and Reconstr Surg，2003，1：26-29.

［13］Vroemen M，Weidner N. Purification of Schwann cells by selection of p75 low affinity nerve growth factor receptor expressing cells from adult peripheral nerve［J］.Journal of Neuroscience Methods，2003，124:135-143.