大段同种异体骨移植复合BMP2和TGF?β2对兔桡骨中段骨缺损愈合的影响
【摘要】 ［目的］探讨外源性TGF?β2和BMP2复合同种异体骨对骨缺损愈合的作用。［方法］用兔桡骨骨缺损模型，在骨缺损局部单独或联合应用TGF?β2和BMP2与同种异体骨复合，A组：同种异体骨与BMP2复合；B组（对照组）：自体骨；C组：同种异体骨与TGF?β2复合；D组：同种异体骨与TGF?β2、BMP2复合；通过不同时间X线片、生物力学、骨密度和骨痂钙含量的检测对骨缺损愈合情况进行评估。［结果］B组的骨痂钙含量、骨缺损愈合情况和愈合后的力学强度明显优于A、C、D组（P＜0.01），D组优于A、C组（P＜0.05），C组优于A组（P＜0.01）。［结论］TGF?β2和BMP2在骨缺损愈合过程中均发挥了重要的作用。在兔骨缺损周围局部应用外源性TGF?β2和BMP2与同种异体骨复合，可明显促进骨缺损愈合，使骨痂量增加，增强骨折愈合后的力学强度。并且在骨折愈合时间上接近自体骨移植骨折愈合的时间，从而在临床上缩短了需要大段植骨患者时间，减轻了患者痛苦。单用TGF?β2的作用强于BMP2。它们联合应用时，这种作用进一步增强，在促进骨缺损愈合方面具有协同作用。同时也为异体骨复合何种因子及因子的剂量提供可靠的指标。
【关键词】 同种异体骨； 转化生长因子β2； 骨形态发生蛋白?2； 移植
同种异体骨是仅次于自体骨的骨移植替代材料，它不仅具有骨传导作用，同时还具有一定的骨诱导能力〔1〕。转化生长因子β2（transforming growth factor?beta 2，TGF?β2）和骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）是骨形成与修复过程中重要的细胞因子〔2～4〕。单纯应用外源性BMP2和TGF?β2促进骨愈合的报道较多，但将外源性BMP2和TGF?β2复合用于骨折治疗的报道较少，而与同种异体骨复合则未见相关报道。同时外源性TGF?β2和BMP2对骨愈合相互作用的关系目前尚不很清楚，其与同种异体骨的兼容与否尚待进一步探讨。本实验是将同种异体骨移植与细胞生长因子复合起来，充分发挥BMP2和TGF?β2的治疗作用和同种异体骨支架的基床及引导作用，同时也为今后的研究工作提供参考。
1 材料与方法
1.1 同种异体骨的制备，参照〔5〕的方法。
1.2 BMP2和TGF?β2缓释微粒，均购于美国Cytolab公司。
1.3 动物
新西兰大白兔，雌雄各半，兔龄6～7个月，骨成熟，体重2.5～3 kg，由山西省农科院畜牧研究所试验兔场提供。
1.4 方法
1.4.1 实验分组
48只兔，随机分为同种异体骨+BMP2 、同种异体骨+TGF?β2、同种异体骨+BMP2+TGF?β2、自体骨（对照组）4组，每组12只，各组的性别和重量可比。
1.4.2 动物实验模型的建立
3%戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉，无菌条件下做双前肢中段前外侧纵行切口约20 mm，暴露桡骨，在小骨膜剥离器保护下用口腔涡轮转于桡骨中段横行锯断，切除骨段（连同骨膜）10 mm，清洗创面，按表1植入各种材料，逐层缝合筋膜和皮肤，分笼饲养。术后3 d 40万U青霉素肌肉注射，1次/d。术后4、8、10、12周，ABCD组各随机选择3只动物，空气栓塞处死，游离桡骨标本备检。
表1 分组和处理（略）
1.4.3 BMP2和TGF?β2的用法
参照Miyamoto〔6〕的方法，在各个实验组内BMP2和TGF?β2的含量分别为100 μg和20 mg。手术当天将各个缓释微粒用负压系统置入异体骨，对照组在相应部位置入自体骨，作空白对照。
1.4.4 X线片观察
各组动物的桡骨分别在100 mA、50 KV、10 ms、靶物距75 cm的条件下摄X线正侧位片。对术后第4、8、10、12周，X线正侧位片显示的骨痂在图形分析系统上使用qwin软件作图像分析，测定外骨痂的总面积。
1.4.5 骨标本采集
拍摄X线片后，各组动物予静脉注射过量空气栓塞处死，完整取下桡骨，清除各种软组织，作进一步分析。
1.4.6 生物力学测定
对术后12周的桡骨标本在万能材料试验机上作三点弯曲、最大破坏载荷试验，测定标本骨折端的最大破坏载荷和最大位移（由太原理工大学生物力学研究所提供）（图1）。
图1生物力学三点弯曲模式图（略）
1.4.7 骨密度（骨痂处）测定
做完X线检查的标本，去除标本表面的所有软组织，用美国Luner公司DPX?IQ型双光子骨密度测定仪（DEXA）测量骨缺损区新骨的骨密度（BMD），采用普通区域分析方式，在骨缺损区（R1）以尽量包含全部骨缺损的最小面积为原则，扫描分析测定不同时间标本骨缺损区的骨密度，小动物实验软件分析测定结果，并进行统计学分析（图2）。
图2骨密度测定感兴趣区R1（方块）（略）
1.4.8 单位质量骨痂中钙含量测定
取骨折近端骨痂，经漂洗、脱脂、烘干后，精确称重，用三氯乙酸0.1 g／ml脱钙，回滴定法测定钙含量。
1.4.9 统计学处理
计量资料用x-±s表示，差异的显著性用方差分析，各实验组之间比较用LSD法检验，与对照组之间比较用Dunnett检验。
2 结果
2.1 X线片观察结果
D组术后2周，缺损处截骨线模糊，有密度较低可见均匀的骨痂影，移植骨纹理模糊，出现不规则密度降低区。4周时，缺损内骨痂密度明显增高，充满整个缺损区，并有许多岛状骨化中心，移植骨部分吸收，移植骨与骨缺损端连接线模糊（图3）。8周时，缺损区内骨岛增大，并与骨痂相互融合呈片状密度增高影，部分新生骨皮质与宿主骨皮质连接（图4）。12周时，缺损区新骨形状已接近正常骨组织，中央部已基本形成骨髓腔，并与近、远端相通，外周骨皮质也与两端相连，基本达到正常厚度（图5）。A组在术后8周，仅在骨缺损端有少量新骨形成，并有部分软组织填充，12周时：断端边缘消失，骨膜反应密度更深，密度较骨质低（图6）。C组上述变化均晚于D组（图7～9）。B组在12周已完全愈合（图10）。
图34周D组：缺损内骨痂充满整个缺损区，移植骨部分吸收，移植骨与骨缺损端连接线模糊（略）
图48周D组：缺损区移植骨与缺损断端全部连接，密度较高，新生骨皮质与宿主骨皮质连接 （略）
图512周D组：缺损区已接近正常骨组织，中央部基本形成骨髓腔，并与近远端相通，外周骨皮质也与两端相连（略）
图612周A组：骨缺损区断端边缘消失，密度较骨皮质低（略）
图74周C组：缺损内骨痂未充满整个缺损区，移植骨部分吸收，移植骨与骨缺损端连接线模糊（略）
图88周C组：缺损区移植骨与缺损断端部分连接，部分新生骨皮质与宿主骨皮质连接（略）
图912周C组：缺损区新骨与缺损断端完全连接，密度较高，中央骨髓腔未通，新骨皮质与两端骨皮质相连（略）
图1012周B组：缺损区与移植骨完全连接，外周骨皮质相连，骨髓腔再通（略）
2.2 骨密度测定
术后各时期A、B、C和D 4组分别测定骨缺损区骨密度值（表2）。总体来说：4组的骨密度随时间增加而增加。在各个时间段，对照组的骨密度高于各个实验组，D组的骨密度高于A、C组，其中4周和8周两者比较差异具有显著性。D组在4周和8周时明显低于B组，在10周和12周时已没有明显差别。
2.3 生物力学测定
术后12周，行三点弯曲试验（表3），得各组骨缺损区最大应力如下，B组和A、C组比较有显著性差异，和D组无明显差别。D组和A、C组比较有显著性差异。
表2 各组不同时期骨密度值（略）
C组与D组（x-±s）比较:*P＜0.05;**P＜0.01;A组与D组（x-±s）比较:△P＜0.05;△△P＜0.01;B组与D组（x-±s）比较:*△P＞0.05
表3 12周各组三点弯曲试验数据（略）
C组和D组比较:*P＜0.05;A组和D组比较:△P＜0.05;A组和B组比较:P＜0.01 ;C组和B组比较:P＜0.05;B组和D组比较：P＞0.05
2.4 单位质量骨痂中钙含量
骨折后50 d，对照组单位质量骨痂钙含量（mg）为（257.5±11.4），TGF?β2组为（238.2±15.1），BMP2组为（218.7±16.8），TGF?β2+ BMP2组为（251.2±18.9）。对照组明显高于各组（各治疗组与对照组相比，P＜0.01），TGF?β2+ BMP2组高于单用TGF?β2和BMP2组，TGF?β2组高于BMP2组（各治疗组之间两两比较，P＜0.05）。TGF?β2+BMP2组与对照组比较无差别（P＞0.05）。
3 讨论
骨形态发生蛋白由一个结构和功能相似的多肽因子家族（BMP1除外）组成，属于转化生长因子β超家族的成员。这个家族有43个成员，TGF?β家族的成员在大多数物种都可发现。BMP可诱导骨及软骨形成,BMP2的多样性效能涉及从骨骼、骨外器官形成到骨的发生与重建〔7〕。
研究发现，TGF?β2有诱导和增强骨形成的作用〔1、6〕，BMP2明显促进骨愈合，有较强的骨修复能力〔3〕。将外源性TGF?β2和BMP2复合用于骨折治疗的研究报道较少，而与同种异体骨复合则未见相关报道。同种异体骨从材料本身的角度分析最适于修复骨缺损，Kirker〔8〕 用绵羊的异体骨复合rhBMP?2修复2.5 cm的骨缺损，术后2～4周即可从X线片上见到新骨形成，12周髓腔再通，为异体骨移植中应用BMP提供了实验依据。本实验以同种异体骨为载体，分别制备了TGF?β2/异体骨、BMP2/异体骨、TGF?β2+ BMP2/异体骨缓释系统，局部用在兔桡骨骨折处，从X线片、生物力学、骨密度和骨痂钙含量方面观察外源性TGF?β2和BMP2对骨折愈合的作用。结果表明，在骨折区应用TGF?β2和BMP2，可明显促进骨折愈合，使骨痂量增多，单位骨痂的钙含量明显增加，增强骨折愈合后的力学强度。TGF?β2和BMP2联合应用优于单用一种生长因子，单用TGF?β2好于单用BMP2。而且在第8周时TGF?β2和BMP2联合应用组的骨密度和自体骨组在统计学上已没有明显差别；在第12周时，生物力学在统计学上无显著差异。说明异体骨复合外源性TGF?β2和BMP2可以在骨折愈合时间上最大限度地接近自体骨移植骨折愈合的时间，可以用比其他植入材料短的时间达到相同的效果。通过本实验可估计出愈合时间大概在8～12周，缩短了临床上需要大段植骨患者的治疗时间，减轻了患者的痛苦。其应用前景广阔，同时也可以为异体骨复合何种因子及因子的剂量提供一个可靠的指标。
结果表明，TGF?β的作用强于BMP，可能是TGF?β仅对骨膜间充质细胞作用，不能诱导骨折缺损区周围肌肉中间充质细胞的增殖和分化，其成骨范围仅局限于骨折缺损区内〔2〕。而BMP对已分化、成熟的成骨细胞和成软骨细胞无生物学效应（基本上无促进增殖作用）〔3〕，因而，TGF?β的成骨作用强于BMP。本实验D组结果表明，联合应用对骨折愈合的促进作用明显增强，力学强度进一步加大。这提示它们之间有协同作用。体内研究表明〔3〕，BMP诱导未分化的间充质细胞不可逆地分化为软骨细胞和成骨细胞，通过钙盐沉积，导致新骨形成，启动骨生成，具有高效的异位诱导成骨作用，但对已分化、成熟的成骨细胞和成软骨细胞无作用，它诱导新骨形成的过程需要一些生长因子（如TGF?β）的参与，TGF?β的直接效应是促进骨膜中前成骨细胞的增殖，促进成骨细胞和成软骨细胞的增殖，在骨形成中的基本作用是补充其他生长因子（如BMP）激活已分化的细胞，无异位成骨活性。大量研究证实，BMP是唯一能够诱导异位成骨的生长因子，TGF?β只有在BMP存在时，才能诱导异位成骨。因此，当TGF?β和BMP复合时，BMP的异位骨诱导作用弥补了TGF?β的不足，使TGF?β的成骨能力增强，而TGF?β能增加BMP的诱导能力。由此可见，在促进骨生成方面，TGF?β和BMP之间有良好的协同作用。
本实验结果显示同种异体骨能够和上述两种因子很好的兼容并且彼此之间有良好的协同作用，但目前对于同种异体骨植入后愈合机理、免疫反应等的研究尚未十分透彻，而且在如何保存骨组织，以求在安全前提下最大程度地降低免疫原性，并加快植入后的骨愈合速度等方面亦存在争议，有待进一步研究。
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