siRNA特异性抑制骨肉瘤细胞株HER?2基因的表达

            作者：王玉峰，王岩峰，祝勇，邴佩旭

【摘要】  ［目的］观察RNA干扰技术对骨肉瘤细胞株（OS?732细胞）HER?2（表皮生长因子受体?2）表达的抑制效应。［方法］体外化学合成HER?2序列特异性双链RNA（siRNA），转染入OS?732骨肉瘤细胞株中，分别用RT?PCR、Western Blot和免疫细胞化学法检测转染前后HER?2基因的mRNA和蛋白的表达情况，用MTT（四甲基偶氮唑盐比色法）检测细胞的增殖和化疗敏感性，观察细胞生物学特性的改变。［结果］HER?2 siRNA对OS?732细胞HER?2 mRNA表达明显抑制，作用约持续10 d；干涉第9 d，干涉组细胞蛋白表达减弱；细胞对顺铂的敏感性提高约10倍。［结论］体外合成的siRNA能有效抑制骨肉瘤OS?732细胞中HER?2基因的表达，抑制细胞的增殖，并提高了细胞对顺铂的敏感性。

【关键词】  RNA干扰； siRNA； 骨肉瘤； HER?2

    Abstract：［Objective］To investigate whether RNA interference（RNAi）could suppress the expression of HER?2 in osteosarcoma OS?732 cells.［Method］OS?732 cells were transsfected using chemically synthesized double stranded RNA（dsRNA）formulated with Lipofectamine 2000.The HER?2 gene expression inhibition was assessed by RT?PCR,Western Blot and immunocytochemistry.The chemosensitivity of transfected cells to cisplatin was determined by MTT measurement.［Result］Sequence specific siRNAs targeting HER?2 down?regulated the expression of HER?2 significantly.Currently,a range of effects on cell physiology,such as growth inhibition or apoptosis,was observed,Introduction of the siRNA into HER?2 positive tumor lines in vitro greatly reduced the expression of the HER?2 mRNA,effects lasted for 10 days,On the 9th day of interference,HER?2 protein expression was down?regulated in interference group.After RNAi,HER?2?siRNA increased thesensitivity of OS?732 to cisplatin by 10?fold.［Conclusion］Sequence specific siRNAs targeting HER?2 can suppress the expression of HER?2,and significantly inhibiting cellular proliferation,increasing the sensitivity of OS?732 to eisplatin.The successful application of HER?2 siRNA for inhibition of proliferation in HER?2 overexpressed cells extends the list of available therapeutic modalities in the treatment of human osteosarcoma.

    Key words：RNA interference；  siRNA；  osteosarcoma；  HER?2

    骨肉瘤（osteosarcoma）是目前世界上青少年中死亡率较高的恶性肿瘤之一。骨肉瘤细胞在发生基因表达变异后常伴随相关肿瘤基因表达的改变，深入研究其分子机理具有重要意义。RNAi能对抗外源导入基因所表达的mRNA等外源基因的侵害，高效特异的阻断基因的表达是RNAi的一大特征，对该技术的研究已成为肿瘤的重要方向〔1〕。癌基因产物HER?2是表皮细胞生长因子受体（EGFR）家族中的重要成员。HER?2在人类恶性肿瘤中的高表达，被证明与肿瘤的侵袭性相关，抑制该受体功能是肿瘤治疗的重要方向。本文通过采用RNAi技术抑制人骨肉瘤细胞HER?2的表达，从而为骨肉瘤的基因治疗提供新策略。

    1  材料和方法

    1.1  材  料

    人骨肉瘤OS?732细胞株购自北京积水潭骨科研究所，HER?2单抗购自北京中山公司，Reverse transcription system，Trizol，dNTP购自大连宝生公司，Taq DNA聚合酶购自Takara公司。HER?2引物序列为：F5′CCTGCTGAACTGG TGTATGCA 3′，R5′ TCAGAGTAATCATCAAATTG 3′，由Takara公司合成，预扩增片断产物为429 bp。以β?actin作内对照，引物序列为；F5′ GATTGCCTCAGGACATTTCTG3′，R5′ GATTGCTCAGGACATTTCTG 3′；扩增产物长为690 bp。

    1.2  方  法

    1.2.1  siRNA合成

    根据HER?2基因在GenBank中的序列设计相应的siRNA：从启动子下游75碱基处找到第1个AA二聚体，记录AA下游19个碱基序列为目的序列，目的序列中嘌呤和嘧啶的含量百分比（G／C）〔2〕。应用BLAST检索，确认所设计siRNA序列的惟一性。人工合成针对2644?2664nt位碱基靶序列的2条寡核苷酸链。siRNA F5′?CUGGUGUAUGCAGAUUGCCUU?3′，siRNA R5′?GGCAAUCUGCAUAC ACCAGUU?3′。序列非特异性siRNA：siRNA F5′?CUUGUAUGGGCAAUGCUU?3′，siRNA R5′-GGCAAUCUGCCCAUACAAGUU?3′。

    1.2.2  细胞培养及转染

    骨肉瘤细胞分组：A组为空白对照（未转染）；B组转染非特异性的siRNA；C组转染特异性的siRNA。转染前24 h，取对数生长期的细胞胰酶消化，计数，调整细胞浓度为1×105／ml，接种，孵箱培养36 h，待细胞培养达80％融合。转染：（1）配制液体，A液：7.5 μl siRNA+250 μl McCoy?5A培养基；B液，10 μl Lipofectamine+250 μl McCoy?5A培养基，吹匀，室温5 min。（2）A液与B液混合，吹匀，室温放置20 min。（3）将混合液加入6孔培养板中培养6 h，对照组只加10 μl Lipofectamine+250 μl McCoy?5A培养基。（4）6 h后，换液，置培养基中培养48 h。

    1.2.3  RT?PCR法检测HER?2 mRNA

    首先进行培养细胞总RNA抽提，取5 μl RNA水溶液在琼脂糖凝胶电泳上检测RNA质量，用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，-70℃保存。取2 μl总RNA，首先逆转录合成cDNA。反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，75 ℃延伸45 s，共进行30循环，最后75 ℃延伸10 min。以β?actin基因作为内对照。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，照相、分析。

    1.2.4  Western Blot法检测HER?2蛋白

    细胞经4％SDS裂解，超声剪切DNA，提取细胞总蛋白，采用考马斯亮蓝法蛋白定量。各组样本分别取总蛋白300 μg，经10%SDS?PAGE电泳后转PVDF膜。与特异性一抗37 ℃温育2 h，4 ℃过夜。与二抗室温孵育2 h后，显色，观察。

    1.2.5  免疫细胞化学法检测HER?2的表达

    自培养瓶中取出载细胞的玻片，经4％多聚甲醛固定，行免疫细胞化学染色，一抗为HER?2，DAB显色。镜下吸光度值（A）分析，半定量检测HER?2的表达。

    1.2.6  MTT法检测HER?siRNA对细胞生长的影响及化疗敏感性

    细胞制成单细胞悬液后，接种于96孔培养板，接种密度为1×103／孔／96孔培养板。每组5孔细胞。分别于培养第0、3、6、9和12 d检测各孔吸光度（A）值。MTT法检测细胞增殖，实验3次，求平均值。采用转染非特异性siRNA及未转染的OS?732细胞做对照。化疗敏感性分析：应用HTT法。细胞贴壁后，加入0～50 μg／ml不同浓度的顺铂培养24 h。试验结果以细胞存活率表示，细胞存活率=（试验组A值／对照组A值）×100%。

    1.2.7  统计学处理

    结果以x-±s表示，用SPSS 10.0统计学软件进行分析，数据采用配对资料t检验，多组间比较用方差分析进行。不同浓度的顺铂与细胞存活率之间剂量效应关系及IC50采用Origin 6.0软件。

    2  结  果

    2.1  RT?PCR检测结果

    紫外分光光度仪测定未转染的骨肉瘤OS?732细胞、转染特异性siRNA及转染非特异性siRNA的骨肉瘤细胞的RNA质量，确认所抽提的RNA无DNA污染，无降解。RT?PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，发现干涉后第3 d开始出现HER?2表达消失，抑制作用可持续10 d左右（图1）。

    图1RNA干涉后骨肉瘤细胞HER?2 mRNA表达  M：DL 2000标准物；C为空白对照组的细胞；3-13为RNAi后3～13 d骨肉瘤细胞2.2  转染后的HER?2蛋白的检测

    Western Blot法检测HER?2蛋白的表达水平，结果表明：干涉第9 d后开始出现蛋白表达的消失，约持续9 d左右（图2）。

    图2RNA干涉HER?2后骨肉瘤细胞HER?2蛋白表达  C为空白对照组的细胞；D7-19为RNAi后7～19 d骨肉瘤细胞2.3  免疫细胞化学法检测HER?2的表达

    空白对照组（C组）HER?2存在一定的表达，干涉自第8 d始HER?2的表达减弱，约持续9 d左右。组间差别具有统计学意义（图3、4）。

    2.4  HER基因沉默后对细胞增殖影响

    骨肉瘤细胞在转染HER?2 siRNA后第6 d，细胞增殖缓慢（P＜0.01），转染非特异性的siRNA及未转染siRNA的细胞对细胞增殖均无明显影响（P＞0.05）。化疗敏感性分析：暴露于顺铂36 h后，3组细胞存活率均随顺铂浓度的增加而降低，但降低的幅度不同，其中，转染HER?2 siRNA组细胞降低最为显著。Origin 6.0分析结果，显示IC50转染特异性siRNA组（2.17±0.11）μg／ml；转染非特异性siRNA组（26.29±0.21）μg／ml；空白对照组（27.01±0.16）μg／ml。HER?2 siRNA可将骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性提高10倍。

    图3空白对照组HER?2的表达  图4RNA干涉后骨肉瘤细胞HER?2的表达3  讨  论

    在正常组织中，骨细胞的增殖和凋亡间保持动态平衡，这是其结构完整和功能健全的基础。这种平衡有赖于肿瘤基因和抑肿瘤基因的调控，一旦失控，癌基因被激活而抑癌基因被抑制，促使增殖加快，DNA损伤增加但得不到修复，产生非整倍体，凋亡机理不能相应启动，则使细胞获永生，最终进展到骨肉瘤细胞。

    RNA干涉（RNA interference，RNAi）技术是近年起来的基因沉默技术，是利用双链RNA（dsRNA）特异性地降解具有同源序列的mRNA，从而特异性地阻断相应基因的表达。已有研究证明siRNA在哺乳动物体细胞中成功的抑制了一系列基因的表达，而且抑制基因表达的时间可以随意控制，在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应〔3、4〕。表皮生长因子受体（EGFR）是一种糖蛋白的跨膜受体，也叫HER?1。这个家族一共4个成员（HER?1、HER?2、HER?3和HER?4）。HER?2基因及其编码的185kD具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白在控制细胞正常生长和发育的信号转导中起着关键作用〔5〕。至今HER?2蛋白受体的确切配体还不明确，但与HER?1、HER?3或HER?4等受体结合的配体却可以激活HER?2。因此，HER?2就成为共受体，可以被许多生长因子激发而扩增信号。由于这一特性的存在可以在癌细胞产生的多种基质衍化而来的生长因子激发下扩增信号，若能把HER?2的信号功能敲除就能削弱恶性细胞的生长。骨肉瘤OS?732细胞株是HER?2过表达细胞株，以往研究证实运用反义寡核苷酸的方法可下调HER?2表达，从而改变肿瘤的生物学特性。相比之下，siRNA敲除基因的效果将更为确切。有报道，siRNA阻断基因表达的效果至少比反义寡核苷酸的方法强10倍〔6〕。

    本实验的研究结果显示序列特异性HER?2 siRNA可高效特异抑制骨肉瘤OS?732细胞HER?2表达，抑制细胞增生，显著增加细胞对顺铂的敏感性。本研究体外合成特异siRNA，通过脂质体转染方法将siRNA转入人骨肉瘤细胞系，可产生瞬时抑制目的基因表达的作用，用RT?PCR、Western Blot及组化法检测干涉效果，结果显示siRNA有效抑制了HER?2 mRNA的转录，该抑制作用可维持10 d左右。由于该突变蛋白表达增高，其半衰期也较长，所以在第9 d后始出现蛋白下调，考虑可能与该基因表达蛋白的半衰期与合成的速度有关。阻断HER?2基因后蛋白的消失迟于mRNA的消失，进一步证实RNAi是在转录水平降解mRNA的，在降解mRNA后，蛋白仍存在表达，直至其剩余蛋白消失，当RNAi的作用消失后，又有新的mRNA产生，于是新的蛋白又重新合成，因此蛋白的消失与出现是迟于mRNA的消失与出现的。作为顺铂的耐药株，本实验检测在阻断HER?2基因后，OS?732细胞对顺铂的敏感性提高约10倍，显示了良好的应用前景。

    尽管siRNA敲除靶基因是瞬时的，但其稳定、高效的抑制效果提示：（1）RNAi可以成为肿瘤细胞中抑制特定基因表达的有力工具；（2）随着表达载体的研究深入，其稳定、持久的特点受到重视，从而为骨肉瘤的基因提供新策略。

【参考文献】
  〔1〕 李鲲，杨述华，刘红云,等.Survivin基因干扰RNA对骨肉瘤MG?63细胞系增殖和凋亡的影响［J］.矫形外科杂志，2006，3，14：373?375.

〔2〕 Overhoff UJ,Alken U，Far RK，et al.Local RNA target structure influences siRNA efficacy：a systematic global analysis［J］.Mol Biol,2005，348（4）：871?881.

〔3〕 Haney SA.RNAi and high?content screening in target identification and validation［J］.I Drugs,2005，8（12）：997?1001.

〔4〕 Gunter M，Thomas T，Mechanisms of gene silencing by double?stranded RNA［J］.Nature，2004，431（16）：343?349.

〔5〕 King BL，Carter D，Foellmer HC，et al.Neu proto?oncogene amplification and expression in ovarian adenocarcinoma cell lines［J］.Am J Pathol，1992，140：23.

〔6〕 Miyagishi M，Hayashi M，Taira K.Comparison of the suppressive effects of antisense oligonucleotides and siRNAs directed against the same targets in mammalian cells［J］.Antisense Nucleic Acid Drug Dev，2003，13：1?7.