改良化学去细胞同种异体神经制备方法的实验研究

            作者：王冠军，孙明学，卢世璧*，许文静，赵斌，彭江，张莉，黄靖香

【摘要】  目的］改进去细胞异体神经化学萃取制备方法，制备出细胞及髓鞘去除完全、神经机构保存完好的去细胞异体神经移植物。［方法］SD大鼠14只，取双侧坐骨神经（共28根），分3组进行化学萃取去细胞处理：Sondell法组（10根）、改良法组（10根）和 对照组（8根）。Sondell法组所用萃取剂为Triton X-100和脱氧胆酸钠；改良法组所用萃取剂为Triton X-200、SB-10和SB-16；对照组未进行化学处理。处理后神经行HE染色、快蓝染色、基底膜素免疫组化染色及环境扫描电镜观察，并从去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性三方面综合评价。［结果］在去细胞异体神经物理性状方面，改良法制备的去细胞异体神经韧性弹性略好于Sondell法；HE染色表明，2种方法的去细胞效果均较好，但改良法对神经结构的破坏较小；快蓝染色、基底膜素免疫组化染色、环境扫描电镜结果均表明，改良法在对髓鞘的去除、基底膜素的保留及神经结构的保存方面均优于Sondell法；综合质量评分结果表明，2种方法在去细胞效果方面相似（P1＞0.05），髓鞘去除及神经结构的保存方面改良法优于Sondell法（P2、P3＜0.05），综合去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性３方面，改良法制备的去细胞异体神经质量优于Sondell法（P4＜0.05）。［结论］综合运用萃取剂Triton X-200、SB-10和SB-16的化学萃取方法，是一种较为理想的去细胞异体神经制备方法，能够制备出免疫物质清除完全、神经结构较好保存的去细胞异体神经移植物，为自体神经移植找到了较好的替代解决方法。

【关键词】  周围神经； 化学萃取； 去细胞异体神经

　　自体神经移植是目前 临床上修复周围神经缺损的“金标准”，但有诸多缺点：增加手术创伤，造成供区功能障碍；且因供体有限，常无法满足较大神经缺损或较广泛神经损伤修复的需要。异体神经是人们一直想利用的自体神经移植替代材料，但是新鲜异体神经移植会导致移植失败的免疫排斥反应。采用化学萃取方法能较好地降低异体神经的免疫反应，但处理不同，有时对神经的结构破坏太大。目前已认可的化学制备方法有Sondell法，即运用萃取剂Triton X-100和脱氧胆酸钠。但此法仍有许多待改进之处［1］，神经基底膜管及细胞外基质结构仍存在不同程度的破坏，影响神经的再生。本研究旨在进一步改良去细胞异体神经的制备方法，在清除神经免疫原性物质的同时，较好地保存了其三维网管状结构，以期研制出一种更为理想的去细胞异体神经移植物。
   
　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物
   
　　雄性健康成年SD大鼠14只(解放军总动物中心提供)，体重270～300 g/只。

　　1.2  实验仪器、试剂
   
　　回旋式恒温振荡器(上海)，环境扫描电镜（QUANTA 400，清华大学提供），Triton X 100，脱氧胆酸钠，Triton X 200 ，sulfobetaine-10 (SB-10)， sulfobetaine-16 (SB-16)，上述试剂均购自美国Sigma公司。

　　1.3  去细胞异体神经的分组及制备
   
　　取14只大鼠，用10%水合氯醛0.4 ml/100 g麻醉后,切取双侧坐骨神经，每根神经长约20 mm，共28根神经。仔细剔除神经外脂肪、血管及结缔组织。分3组进行处理：Sondell法组（10根）、改良法组（10根）和 对照组（8根）。Sondell法组所用萃取剂为：Triton X-100和脱氧胆酸钠，步骤为：（1）蒸馏水中振荡浸浴12h；（2）3%Triton X-100溶液中振荡萃取12h；（3）4%脱氧胆酸钠溶液中振荡萃取24h；（4）重复上述步骤1次；（5）蒸馏水冲洗30 min。改良法组所用萃取剂为：Triton X-200、SB-10和SB-16，步骤为：（1）蒸馏水中振荡浸浴12 h；（2）125mmol/L SB-10溶液中振荡萃取12h；（3）0.14% Triton X-200和0.6 mmol/L SB-16溶液中振荡萃取24 h；（4）重复上述步骤1次；（5）PBS（pH=7.2,下同）冲洗30 min。2种方法处理均在25℃下进行，处理后的神经于4℃下、PBS液中储存备用。对照组神经不作化学处理。

　　1.4  去细胞异体神经的组织学评价

　　1.4.1  光镜观察  3组各取神经6、6、4根，于各神经同位置处切取神经（横向切片取5 mm长神经，纵向切片取10 mm长神经），常规石蜡包埋,厚为5μm的横向和纵向组织学切片；HE染色,观察去细胞程度和围绕神经轴突的基底膜管结构的完整性；快蓝染色,观察髓鞘残留成分；基底膜素免疫组化染色，观察基底膜素的保留。

　　1.4.2  扫描电镜观察  3组各取神经4根，于2%OsO4（2%锇酸）溶液中固定24 h后，二甲胂酸钠缓冲液冲洗，滤纸蘸干水分，投入液氮中冷冻，取出后迅速切成5 mm小段，于冷冻干燥机中干燥固定后，环境扫描电镜下观察基底膜管结构的完整性及去髓鞘程度。

　　1.4.3  去细胞异体神经质量评价  按下述评分标准［2］：（1）去细胞程度：去细胞完全评为0分，残余细胞占总数的百分率≤25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分别评为1、2、3、4分；(2)髓鞘染色分级：（－）、（±）、（＋）、（＋＋）分别评为0、1、2、3分；(3)基底膜管完整性：结构完整无破坏评为0分，结构破坏占总面积的1%～25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分别评为1、2、3、4分。正常神经各组织学染色作为对照。由病理专业人员按去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性观察的标准，行双盲观察计分，综合评分，分数越低，表示制备的质量越好。

　　1．5  统计学分析
   
　　用SPSS 11.5统计分析软件进行数据处理，组间对比用成对资料的t检验，P<0.05时，有显著性差异。
   
　　2  结果

　　2.1  物理性状
   
　　Sondell法与改良法制备的去细胞异体神经，在外观上无明显差别，均呈淡乳白色、略透明外观，其直径和长度均略小于化学萃取前的新鲜神经。牵拉2种方法制备去细胞异体神经，其延展性均较化学萃取前略增加。显微镜下行神经外膜缝合操作，感其韧弹性略差于新鲜神经，但均可在无张力下行常规的神经吻合，改良法制备的去细胞异体神经韧弹性略好于Sondell法，但无统计学意义。

　　2.2  常规组织学观察

　　2.2.1  HE染色  正常神经可观察到轴突、雪旺细胞及细胞外基质等结构。Sondell法组与改良法组中纵切片上均见不到任何细胞，红染的神经内膜呈波浪状纵形排列，轴突、髓鞘结构消失而形成管柱状空隙；横切片上轴突及细胞均消失,代之以红染的神经内膜形成的不规则圆形空腔，周边可见到红染的神经束膜及外膜。Sondell法组在纵切片中于红染的神经内膜之间出现了大的空隙；在横切片中于红染的经内膜圆形空腔间出现了大的空隙，而改良法组在纵、横切片，神经内膜管的排列均匀一致，均未出现大的空隙（图1a、1b）。

　　2.2.2  快蓝染色  正常神经可观察到蓝色的髓鞘和蓝黑色的细胞核结构。Sondell法组与改良法组中均显示细胞完全消失、髓鞘大部分消失。 Sondell法组残留的髓鞘染色较重，改良法组较轻（图2a、2b）。

　　2.2.3  基底膜素免疫组化染色  正常神经纵切片上,染成金黄色的基底膜素呈带状纵形排列；横切片上，黄染的基底膜素绕在轴突的外周，形成不规则圆形空腔。Sondell法组与改良法组中均可见到大部分黄染的基底膜素的保留。 Sondell法组中基底膜素染色较轻，改良法组较重。

　　2.3  环境扫描电镜观察
       
　　正常神经可由髓鞘和基底膜环绕形成的圆形小空腔，空腔管壁完整无破坏。Sondell法与改良法制备的去细胞异体神经均可见到基底膜保留，管腔扩大。Sondell法制备的去细胞异体神经可见到较多的空腔管壁不完整，相互融合连成大的空腔。改良法中小空腔排列规范，管壁破坏的较少，较少见到融合的大空腔（图3a、3b）。

　　2.4  质量评价
   
　　病理切片的去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性，评分见表1。Sondell法组与改良法组在去细胞程度、髓鞘染色分级、结构完整性以及综合质量评分(综合去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性)的统计量分别用t1、t2 、t3、 t4及P1、 P2、 P3、P4表示，统计学分析见表2。

　　表1  化学去细胞异体神经质量各标本评分（略）

　　表2  化学去细胞异体神经质量评分统计（略）

　　*无统计学意义；**有统计学意义
   
　　3  讨论
   
　　去细胞异体神经移植物是自体神经移植较好的替代物。影响去细胞异体神经移植物质量的主要因素有免疫原性物质的去除程度和神经三维网管状结构的完整性。
   
　　在同种异体移植中，与免疫排斥反应有关的是组织中存在的主要组织相容性抗原（MHC），其中MHCⅠ类抗原的影响程度较MHCⅡ类抗原弱。在周围神经的结构组成中，同种异体移植的抗原性主要存在于雪旺氏细胞和髓鞘，而由胶原组成的神经内膜、神经束膜和神经外膜的抗原性则非常弱。其中，移植物中的雪旺氏细胞与免疫排斥反应有着十分重要的关系，同种异体神经移植时在雪旺氏细胞上表达很强的MHCⅠ类和Ⅱ类抗原［3］。

   
　　为降低同种异体神经的抗原性，减轻移植后发生的免疫排斥反应，同时保持良好的神经再生，人们尝试采用了多种方法对同种异体神经移植进行预处理，如低温保存、冻融、冷冻干燥、冷冻放射和化学萃取［4, 5］等。虽然冻融法能杀死细胞，去除免疫原性，但不能清除细胞碎片，且常常引起基底膜碎裂。由于细胞碎片的存在，巨噬细胞和雪旺氏细胞侵入基底膜管进行吞噬。这种细胞侵入在神经再生的早期起阻碍作用，且进一步破坏基底膜。放射法也能杀死细胞，去除免疫原性，且不会引起组织形态的破坏，但同冻融法一样，不能清除细胞碎片，继而细胞侵入，破坏结构，阻碍再生。化学萃取法能杀死细胞，降低免疫反应，同时清除大部分细胞碎片，但如果萃取剂的选择不当，不但影响免疫原物质的去除，且易引起神经形态结构的破坏［6, 7］。
   
　　目前得到认可的化学萃取方法有Sondell方案，即运用萃取剂Triton X-100和脱氧胆酸钠。该方法已在小动物、大型哺乳动物体内修复神经缺损取得成功，并在临床应用取得较满意疗效［8］，但此法仍存在基底膜管的部分破坏。基底膜管及细胞外基质在轴突再生的过程中起支架作用。此外，基底膜中的主要分子组——基底膜素，在促进轴突的生长及趋化性再生中均起到重要的作用。如细胞的迁移、黏附、生长和分化，组织的再生等。在周围神经系统中，基底膜由雪旺氏细胞分泌，它对雪旺氏细胞的迁移、分化和髓鞘化起重要作用，同时在促进轴突再生中也起重要作用［9］。活性雪旺氏细胞持续表达基底膜素分子，并将其递送到基底膜用以作为其主要的活性组份。
   
　　萃取剂分为4种类型［6］：(1)非离子型，如Triton X-100 ；(2)两性型，如  SB-10， SB-16；(3)阴离子型，如Triton X-200，脱氧胆酸钠；(4)阳离子型。本实验不选择阳离子型萃取剂的原因是：阳离子型表面活性剂作用太强，易引起结构蛋白变性、破坏，且阳离子型萃取细胞毒性作用最强。非离子型及两性型萃取剂在保存神经结构方面效果较好，阴离子型和阳离子型萃取剂在去除细胞方面效果较好，因此要综合权衡。萃取剂Triton X-200属阴离子萃取剂，作用较非离子型萃取剂Triton X-100温和，也就是说在去细胞效果相当的情况下，Triton X-200对神经的结构破坏较少。选择两性型萃取剂SB-10， SB-16的原因是：阴离子型与两性型结合能促进离子紧密结合，从而增强萃取效果。较温和的化学处理能在去除细胞、髓鞘等免疫原物质的同时较好地保存神经三维结构。因此，本实验改良运用萃取剂Triton X-200、SB-10和SB-16进行萃取，效果要优于运用萃取剂Triton X-100和脱氧胆酸钠的Sondell萃取法。
   
　　在去细胞异体神经物理性状方面，改良法制备的去细胞异体神经韧弹性略好于Sondell法；HE染色表明，2种方法的去细胞效果均较好，但改良法对神经结构的破坏较小；快蓝染色表明，改良法对髓鞘的去除较为彻底；基底膜素免疫组化染色表明，改良法对基底膜素的保留好于Sondell法；环境扫描电镜表明，改良法对神经结构的保存好于Sondell法；综合质量评分结果表明，2种方法在去细胞效果方面相似（P1＞0.05），髓鞘去除及神经结构的保存方面改良法优于Sondell法（P2、P3＜0.05），综合去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性三方面，改良法制备的去细胞异体神经质量优于Sondell法（P4＜0.05）。
   
　　综上所述，综合运用萃取剂Triton X-200、SB-10和SB-16的化学萃取方法，是一种较好的去细胞异体神经制备方法，能够制备出免疫物质清除完全、神经结构较好保存的去细胞异体神经移植物，显示了良好的应用前景。当然，本实验研究对象是大鼠坐骨神经，应进一步摸索这种制备方法应用于大型哺乳动物时，制备浓度的选择及进行体内动物实验，以期应用于临床，从而替代自体神经移植。
   
　　(本文附图见加页1)（略）
   

【】
  　　［1］ 衷鸿宾，卢世璧，赵庆，等. 犬化学去细胞神经同种异体移植的神经再生研究［J］. 中华手外科杂志，2002，18：131-133.

　　［2］ 孙明学,卢世璧,唐金树, 等. 化学去细胞异体神经修复神经缺损长度的实验研究［J］.矫形外科杂志，2006，14（8）：603-607.

　　［3］ Annselin AD, Pollard JD. Immunopathological factors in peripheral nerve allograft rejection:quantification of lymphocyte invasion and major histocompatibility complex expression［J］. Journal of Neurological Sciences，1990，96：75-88.

　　［4］ Sondell M, Lundborg G, Kanje M. Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction［J］. Brain Res，1998，795: 44-54.

　　［5］ 孙明学，唐金树，许文静, 等. 化学去细胞同种异体神经移植的实验研究［J］.中华骨科杂志, 2006, 26(4): 267-271.

　　［6］ Hudson TW, Liu SY, Schmidt CE. Engineering an improved acellular nerve graft via optimized chemical processing［J］. Tissue Eng,2004,10(9-10):1346-1358.

　　［7］ Hudson TW, Zawko S, Deister C, et al. Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration［J］. Tissue Eng, 2004, 10(11):1641-1651.

　　［8］ 郭义柱，卢世璧，王岩，等.去细胞同种异体神经移植修复人体长段周围神经缺损［J］.中国临床康复，2005, 9(38):26-27.

　　［9］ DubovZ P, Svízenská I, Klusáková I, etc. Laminin molecules in freeze?treated nerve segments are associated with migrating Schwann cells that display the corresponding α6β1 integrin receptor［J］.Glia ,2001,33:36-44.