水通道蛋白与脑水肿

水通道蛋白(aquaporin, AQP)是一种水的分子通道,在动物和植物细胞中已经发现有多种不同的水通道蛋白。由于水通道蛋白的存在,细胞才可以快速调节自身体积和内部渗透压，水通道蛋白对于生命活动至关重要。本文仅就水通道蛋白与脑水肿关系的研究进展进行简单介绍。

一、AQP 的发现与家族种类

过去认为, 水在细胞内外的转运只是通过脂质双分子层扩散来完成。但在某些生理现象中, 如红细胞、肾近曲小管上皮细胞等对水的转运速度非常快, 不能用水简单扩散来解释。Agre [1]等(1988) 在鉴定人类Rh 血型抗原时,偶然在红细胞膜上发现一种新的28KD 的疏水性跨膜蛋白,称为形成通道的整合膜蛋白28 (CHIP) ,1991 年完成其cDNA 克隆,但当时并不知道该蛋白的功能。在进行功能鉴定时,将体外转录合成的CHIP28 cDNA 注入非洲爪蟾的卵母细胞中,发现在低渗溶液中,卵母细胞迅速膨胀,并于5min 内破裂。为进一步确定其功能,又将其构建于蛋白磷脂体内,通过活化能及渗透系数的测定以及后来的抑制剂敏感性等研究,证实其为水通道蛋白。从此确定了细胞膜上存在转运水的特异性通道蛋白,并称CHIP28 为AQP1 。以后又陆续从哺乳动物组织中鉴定出9 种水通道蛋白(AQP2 ～AQP10 ) ,它们与先前克隆的晶体纤维中的主要内源性蛋白(major intrinsic protein ,MIP) 有20 %～40 %的氨基酸序列同源性,目前所发现的水通道均属MIP家族,后经证明MIP 亦有弱的水通道活性,被命名为AQP0。
这些相继发现的专一性运输水的通道蛋白被统称为AQPs。AQP家族，存在于不同的组织器官中, 如：AQP2 存在于肾髓和肾皮质收集管主细胞, 它在调节水的排泄中有重要作用, 约有10% 的肾小球滤过液流经集合管时是在AQ P2 的参与下被重吸收的。AQP5 大量存在于唾液腺和泪腺中, 与唾液和泪液的产生有关[2]。AQP0在眼中有较高的表达, 被认为与晶状体的透明度有关[3]。它们对于维持机体的水平衡起着重要作用,并且与水平衡紊乱所造成的一些疾病有密切关系。
AQPs 除了跨膜转运水外, 近来发现还能通透其它小分子。Tsukaguchi 等[4]据此将其分为三类: Ⅰ类为选择性水通道, 如AQP1、2、4、5； II类对某些中性溶质( 尿素、甘油) 有一定的选择通透性, 如AQP3、7等； Ⅲ类有广泛的选择通透性( 尿素、多元醇、乳酸盐、羧基丁酸、嘌呤、嘧啶等),如AQP9。后两类又称水甘油通(aquaglyceroporins)。
新克隆出来的AQP10对水和中性溶质具有渗透性，却不能渗透甘油和尿素[5]。另一种分类方法就是根据AQPs 功能能否被汞抑制而分为汞敏感性蛋白和不敏感性蛋白[6]。AQPs 家族的绝大多数成员都具有汞敏感性, 即汞制剂能够抑制其对水的通透性；而只有AQP4 和AQP7具有汞不敏感性。据研究AQP4 与AQP1 的组织构成性活性不同的是邻近NPA基序的半胱氨酸缺失,而汞离子和有机汞通过与AQP1残基C189形成硫醇键使其发生构象改变, 引起水通透性下降。近来研究又证实AQP1的70-73 和189残基定位于水孔或其附近，水孔的宽度也是可变的，而pCMBS(一种汞制剂)能通过71- 73残基而调节水通道的功能。

二、AQP4 的结构

水通道蛋白(aquaporin,AQP)在脑水肿病理生机制中到了重要的作用。迄今已在脑内已发现6种AQP，别是AQP1，3，4，5，8，9。AQP3、AQP5和AQP8的生理学功能未见报道外,AQP1主要在脉络丛内皮细胞表达,参与脑脊液生成[ 7 ];AQP9主要存在于室管膜细胞以及下丘脑内侧基底部的室管膜细胞,可能调节中枢神经系统细胞外间隙与体循环之间的信号传递[8]。AQP4 是脑内表达最多的AQP ,因此最可能与脑水肿形成和消除相关。
AQPs 所有成员之间的基因序列具有一定的同源性。AQP4 的基因定位在人染色体 18q11.2 与q12.1 之间的连接处,由四个分别编码127、55、27、92位氨基酸的外显子组成, 并被0. 8、0. 3和5. 2kb 的内含子分隔开。AQ P4的一级结构同其它AQ P 一样, 为跨细胞膜6次的单肽链, 其氨基和羟基末端均位于细胞内, 含3个胞外环(A、C、E) 和2 个胞内环(B、D)。AQ P4整个分子前后两部分在序列上相似, 呈180°定位的正面对称结构, 内部结构与其它AQ P 同源性最高的是位于B 环与E 环上的天冬酰氨- 脯氨酸- 丙氨酸(N PA ) 基序,NPA 基序重叠位于脂质双分子层之间, 产生一个使水分子单线通过的通道, 可使水分子顺渗透压梯度双向转运,这是AQ P 家族成员共有的特征性结构[9]。 AQP4的四级结构是由具有活性、分子量约34kDa 亚单位组成的四聚体。四聚体在膜上的组装是维持AQP 的稳定和其正常功能所必须的 [10] 。AQP4 有3 个mRNA 亚型, 由N 端外显子的差异所决定[11] 。它们分别是AQP41M1 、AQP41M23 和AQP41M23X。AQP41M1 编码的蛋白为M1,AQP41M23 和AQP41M23X 编码的蛋白为M23 。M1 比M23 在N端多22 个氨基酸。亚型的表达存在组织和年龄的差异。
Ken - ichi等[12]发现,AQP4 C端第276～280的5个氨基酸对于AQP4在细胞膜上的固定起着不可替代的作用,它们突变或缺失将导致AQP4不能固定于细胞膜上,影响生物学效应。由于AQP4 在已知的汞结位点上缺乏半胱氨酸, 对汞的水通透抑制作用不敏感, 因而AQP4属于汞不敏感性水通道蛋白(Mercurial-insensitive water channel,MI2WC)。 Amiry - Moghaddam等[13]研究发现,AQP4位点特异性的锚定依赖于抗肌萎缩蛋白复合物 (dystrophincomplex) ,其成员之一的α-syn是维持AQP4在血管周围膜极性分布所必需的蛋白复合物。

三、AQP4 的分布与功能

AQP4 在机体的组织分布很广泛。在呼吸系统中,AQP4 分布于小呼吸道上皮细胞基底侧质膜,该部分呼吸道包括终末支气管和呼吸性支气管,在肺组织中,水通道蛋白在妊娠晚期胎儿开始表达,一直持续至成年,在研究大鼠AQP4 mRNA 表达时,发现AQP4 在妊娠期胎儿仅有微弱的表达,但出生后表达迅速增强,出生后第2d mRNA水平增加8 倍,达最高峰。Yasui 发现,AQP4 出生后表达迅速增强,但持续时间短[14] 。AQP 表达水平的变化提示某些水通道可能参与出生早期肺内液体的快速转运,在这一时期,以AQP1 和AQP4 的作用尤为突出,这对于尽早恢复正常呼吸功能可能具有重要意义。
在消化系统, Huang等[15]应用免疫定位技术发现AQP4蛋白定位在胃腺中部或深部的壁细胞上，而应用点杂交技术发现AQP4mRNA不能定位于壁细胞而是在邻近的粘膜细胞，以及在胃底部的柱形细胞上，呈现蛋白与mRNA分离现象。这些细胞均与泌酸作用有关。在泌尿系统中,肾集合管(CD) 是尿液分泌最后的决定部位,AQP4 位于肾脏CD 上皮细胞基底侧质膜上,主要分布于外髓质内带及内髓质外1P3 的CD 中[16 ] ,在介导水通过肾脏CD 上皮细胞基底侧质膜转运上起重要作用,其功能不受血管加压素(AVP) 调节。 Hoek 等[17 ] 研究AQP4 还表达于肾近端小管S3 段上皮细胞基底侧质膜,AQP4 的表达量可以反映尿液浓缩量和机制,缺少AQP4 的小鼠,尿浓缩功能明显下降。在运动系统中,AQP4 分布在快肌纤维细胞膜上,可能在细胞的收缩中起重要作用。在眼球中,眼球的液体转运是非常活跃的,AQP4 分布于睫状体非色素上皮细胞的基底膜、虹膜色素细胞、视网膜内颗粒层和外颗粒层及神经节细胞层[18 ] ,AQP4在视网膜血管的神经胶质细胞突起也有大量表达。
AQP4mRNA在脑内的表达含量高于眼，肾肺等器官10倍左右，是脑内主要的水通道蛋白。AQP4在侧脑室及导水管的室管膜细胞、脉络丛上皮、软脑膜、下丘脑、视上核、视旁核、海马齿状回和小脑蒲肯野细胞均有明显表达。有研究者通过免疫细胞化学研究发现,AQP4蛋白主要表达于星形胶质细胞和室管膜细胞, 尤其在与毛细血管和软脑膜直接接触的星型胶质细胞表达丰富, 这表明血管周围的星型胶质细胞突起和神经胶质界膜是水分子流动的主要部位。在神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞和脑膜成纤维细胞内未发现AQP4的表达[19]。但Venero等[20]采用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组化和 AQP4mRNA 的原位杂交双染发现,AQP4mRNA 在GFAP免疫阴性细胞中也有表达,认为神经元可能表达少量AQ P4。石向群等[21]发现,AQP4主要分布于面向毛细血管内皮细胞、软脑膜和脑室室管膜侧胶质细胞的细胞膜或足突上,呈明显的极性现象,提示AQP4分布与脑内水分转运具有同向性。高分辨胶体金免疫电泳显微镜观察证实,在朝向血管面及软膜面的胶质细胞膜区有选择性的AQP4高表达。这种分布特点提示AQP4在维持大脑水平衡中起了重要作用,它是胶质细胞与脑脊液以及血管间的水调节和转运的重要结构基础。