细胞内钙在人胃癌细胞缺氧诱导因子?1表达及转录激活中的作用
作者：兰梅，时永全，韩者艺，宁晓喧，樊代明
【摘要】 目的观察细胞内钙变化对氧调节性亚单位HIF?1α表达及其HIF?1转录激活的影响。方法常氧时，采用通透性细胞内钙的螯合剂BAPTA?AM或钙的离子载体Ionomycin降低或升高细胞内钙，用Western?blot检测其对SGC7901细胞中HIF?1α蛋白表达的影响，然后采用间接免疫荧光法、双荧光素酶报告系统及ELISA法检测改变细胞内钙对HIF?1α转位、HIF?1转录活性及其靶基因血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）分泌的影响。结果用BAPTA?AM降低细胞内钙，能诱导HIF?1α的表达，促进HIF?1α的转位，增强HIF?1的转录活性，增加HIF?1调节基因VEGF的分泌。用Ionomycin升高细胞内钙，虽然也有微弱的促HIF?1α稳定及转位作用，但对HIF?1转录活性及VEGF的分泌并无明显影响。结论螯合细胞内钙能诱导胃癌细胞中HIF?1α的表达及HIF?1的转录激活，提示细胞内钙变化可能在胃癌细胞的缺氧信号转导过程中发挥了重要作用。
【关键词】 胃癌细胞；细胞内钙; 缺氧诱导因子?1; 蛋白表达；转录活性
Department of Internal Medicine, the Affiliated Hospital of Medical College of Shaoxing University, Shaoxing 312000, China; Institute of Digestive Disease & State Key Laboratory of Cancer Biology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University
Abstract：Objective To study the possible roles of changed intracellular calcium level in SGC7901 cells on HIF?1α expression and HIF?1 transcriptional activity. MethodsUnder normoxic conditions, the protein expression of HIF?1α in SGC7901 cells after treatment with BAPTA?AM (a cell?permeant Ca2+ chelator), or ionomycin (an calcium ionophore) was observed by Western blot. The effect of BAPTA or ionomycin on nuclear location of HIF?1α, HIF?1 luciferase activity as well as secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF), a typical HIF?1 target gene, was determined by indirect immunofluorescence assay, dual luciferase reporter system and enzyme?linked immunosorbent assay (ELISA) respectively. ResultsDecreasing the intracellular calcium level by BAPTA induced HIF?1α nuclear accumulation, stimulated HIF?1?dependent transcription and enhanced expression of VEGF in SGC7901 cells under normoxic conditions. However, the induction of HIF?1 activity and the secretion of VEGF were not caused by ionomycin application, though it can mediated a weak and transient HIF?1α nuclear accumulation. ConclusionChelation of cellular calcium modulates HIF?1α expression and HIF?1 transcriptional activity in human gastric cancer cells. Changes in intracellular free calcium concentration appeared to have a critical role in hypoxic signal transduction in gastric cancer cells.
Key words：Gastric cancer cells; Intracellular calcium; HIF?1; Protein expression; Transcriptional activity
0引言
近来发现[1]缺氧可使内皮细胞中的Ca2+明显增加，升高或降低细胞内Ca2+，可增加或降低缺氧诱导基因如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等的表达，提示细胞内Ca2+与缺氧诱导基因的表达有关，可能在细胞的缺氧反应中发挥了重要作用。那么对于早期即可出现缺氧的实体瘤来说，作为重要第二信使的细胞内Ca2+是否也与其缺氧信号的调节有关、是否也能通过对HIF?1的调节而影响肿瘤细胞的恶性表型呢？我们前期研究曾证实常氧时在人胃癌细胞SGC7901中即有HIF?1α的表达[2]，为此，本研究主要观察改变细胞内钙对SGC7901细胞中HIF?1α表达及转录激活的影响，以期为胃癌缺氧信号转导机制的阐明奠定一定理论基础，为胃癌的诊治提供一定的思路。
1材料和方法
1.1材料胃癌细胞系SGC7901为第四军医大学西京消化疾病研究所保存； BAPTA?AM购自BIOMOL公司； Ionomycin及β?actin的单抗为Sigma公司产品； HIF?1α多抗为Santa公司产品； FuGENE6转染试剂购自Roche公司； 双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司； VEGF检测试剂盒购自上海森雄公司； pGL?3SV40HRE质粒（在BamHⅠ位点插入2个拷贝的缺氧反应元件）为大阪大学医学院Mayuko Osada 教授惠赠。
1.2方法
1.2.1改变细胞内钙对HIF?1α蛋白稳定的影响－Western blot法消化对数生长期的细胞，铺板，培养过夜；换无血清培养液，分别加入12.5μM BAPTA?AM、1μM ionomycin孵育0、2、4、8、12、24h，收获细胞。三去污裂解细胞制备总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度；取100μg总蛋白上样，行SDS?PAGE电泳，转膜，8%脱脂奶粉封闭2h，加HIF?1α多抗（稀释度1∶200）4℃孵育过夜，TBST漂洗10ｍin×3后，加二抗室温孵育2～3h，洗膜3次，ECL显影。
1.2.2改变细胞内钙对HIF?1α转位的影响－间接免疫荧光化学法胰酶消化并收获对数生长期的SGC7901细胞， 传代于装有载玻片的无菌培养皿中， 培养过夜； 换无血清培养液， 加入12.5μM BAPTA、 1μM ionomycin分别孵育0、 2、 4、 8h后， PBS冲洗3次， 95％乙醇固定， 再次用PBS冲洗10min×3次后， 加0.3% Triton X?100室温10min， 正常山羊血清37℃封闭10min， 加HIF?1α多抗（1∶100）4℃孵育过夜。 PBS溶液洗涤10min×3次， 加入1∶100的FITC标记的羊抗兔IgG， 37℃孵育2h。 PBS洗10min×3次， 荧光显微镜观察照相。
1.2.3改变细胞内钙对HIF?1转录活性的影响－报告基因检测接种对数生长期的SGC7901细胞于48孔板(每孔设3个复孔)，常规培养至70%~80%融合，按FuGENE 6转染试剂说明制备转染复合物加入48孔板(pGL?3SV40?2HRE∶pRL?TK约10∶1)，继续培养24～36h；换用无血清RPMI1640，加入12.5μM BAPTA?AM、1 μM Ionomycin，继续培养8h；吸去培养液，每孔加入80μl被动裂解液，12000r/min离心10min，上清转至新的离心管；取10μl上清和荧光素酶检测试剂Ⅱ（Luciferase Assay ReagentⅡ，LARⅡ）50 μl混合，在TD?20/20荧光发光计第一次检测萤火虫荧光素酶活性，然后加入50 μl Stop & GloTM试剂，混合后第二次检测海肾荧光素酶活性；所有萤火虫荧光素酶活性用海肾荧光素酶活性正态化，所有的实验数据取3个样品平均值，每个实验重复2次。
1.2.4改变细胞内钙对VEGF分泌的影响－ELISA将对数生长期的SGC7901细胞接种于24孔板，每孔设3个复孔；细胞生长至70%~80％融合时，换用无血清培养液，分别加入12.5μM BAPTA、1μM Ionomycin继续培养16h；计数细胞，2000r/min离心、无菌收集细胞培养上清，按ELISA试剂盒说明检测VEGF蛋白含量。
1.3统计学处理采用SPSS10.0软件处理数据，多组均数间的两两比较采用One?Way ANOVA S?N?K进行。
2结果
2.1改变细胞内钙对HIF?1α蛋白表达的影响常氧时，在SGC7901细胞中可以检测到微弱的HIF?1α的蛋白表达，但当在细胞外液中加入12.5μM 细胞内钙的螯合剂BAPTA?AM后，HIF?1α的蛋白表达明显增高，4h达到最大，之后开始降低，24h仍能检测到一定量的HIF?1α蛋白表达见图1A；1μM钙的离子载体Ionomycin似乎也有微弱的促HIF?1α蛋白稳定作用，该作用也以药物作用4h、8h时为著，见图1B。
图1改变细胞内钙对HIF?1α蛋白表达的影响（略）
2.2改变细胞内钙对HIF?1α转位的影响HIF?1α稳定后必须转位于核内才能转录激活，因此，我们进一步采用免疫荧光法观察细胞内钙变化对HIF?1α转位的影响，结果发现如图2所示，BAPTA处理2h后，SGC7901细胞的胞浆及胞核荧光信号均明显增强，几乎无法将胞浆与胞核区别开来；4h时胞核荧光信号有所减弱，胞浆信号依然很强；8h时胞核仍有一定的荧光信号残留，但胞浆信号仍然很强。Ionomycin处理2h时，尽管SGC7901细胞的胞浆荧光信号也明显增强，但胞核仅有微弱荧光信号；4h时胞核染色不但没有降低，反而有所增强；8h时，胞浆、胞核荧光信号均有所降低。提示降低细胞内钙在快速增强HIF?1α表达的同时，能促进HIF?1α的核内蓄积，而升高细胞内钙虽也有促HIF?1α表达及转位的作用，但较前者起作用慢且持续时间短，见图2。
2.3改变细胞内钙对HIF?1转录活性的影响为了证实细胞内钙变化对HIF?1转录活性的影响，我们采用双荧光素酶报告基因检测系统观察改变细胞内钙对荧光素酶活性的影响，结果见图3。常氧条件下，12.5μM BAPTA作用8h，可使SGC7901细胞中荧光素酶活性增高达未处理组细胞的3倍(P<0.05)，而1μM Ionomycin处理组与对照组相似。提示降低而并非升高细胞内钙能增加HIF?1的转录活性。
与对照组比较, *P<0.05
图3改变细胞内钙对HIF?1转录活性的影响（略）
2.4改变细胞内钙对VEGF分泌的影响HIF?1转录激活必将导致其调节基因的转录，为此，我们进一步采用ELISA法检测SGC7901细胞培养上清中VEGF的表达，结果见图4。BAPTA作用16h时，能诱导SGC7901细胞中VEGF分泌的明显增加(Ｐ<0.05)，而Ionomycin处理组细胞中的VEGF含量并无明显改变(Ｐ>0.05)。
与对照组比较, *P<0.05
图4改变细胞内钙对VEGF分泌的影响（略）
3讨论
哺乳动物细胞对缺氧环境的适应很大程度上依赖于其内在的低氧信号传导通路的激活和由此引起的一系列缺氧诱导基因的表达。HIF被证明在这一传导通路中起关键性作用。HIF?1是一种随细胞内氧浓度变化而调节基因表达的转录激活因子，由氧调节性亚单位HIF?1α和组成性亚单位HIF?1 β组成。常氧时，HIF?1α尽管表达，但很快被脯氨酸羟化酶羟化，被肿瘤抑制蛋白pVHL（Von hippel?lindau tumor suppressor protein）识别，而经泛素蛋白酶体系统降解，乙酰化也与常氧时HIF?1α的降解有关。缺氧时HIF?1α的羟化、乙酰化被阻断，其降解被抑制，因而得以稳定下来，转位于核内，与HIF?1β结合形成有活性的HIF?1，从而启动50多种下游基因如p53，VEGF、EPO等的转录，以利于肿瘤细胞在缺氧环境下的继续生存、增殖[3]。尽管目前已经在多种肿瘤组织中检测到了HIF?1α的表达，并证实癌基因或抑癌基因的遗传变异、ROS活性增加、肿瘤细胞中某些生长因子的改变等均与HIF?1α的表达增强有关[4]，HIF?1α的稳定有赖于PI?3K/Akt途径，其转录活性与ERK途径的参与有关[5]，但迄今为止，介导肿瘤细胞中HIF?1表达及活性增加的信号通路并未完全明了，其确切的上游分子仍不是非常清楚。作为重要的细胞内第二信使，细胞内Ca2+在肿瘤细胞缺氧信号调节中的作用也受到越来越多的重视。尽管有报道认为在人肝癌细胞系Hep3B中，细胞内Ca2+在缺氧诱导的EPO和VEGF的分泌中没有发挥很大作用[6]，但多数研究表明细胞内Ca2+与HIF?1的转录激活及其调节基因的表达有关[7]，只不过细胞内Ca2+在HIF?1激活中的作用意见不一。Mottet等[8]证实缺氧或采用Ionomycin升高细胞内钙，可通过ERK途径而致HIF?1的激活；使用细胞内钙的螯和剂BAPTA、钙调素的拮抗剂Calmidazolium和ERK途径的抑制剂PD98059能抑制缺氧时HepG2细胞中VEGF的分泌。而Berchner等[9]发现，常氧时，在神经母细胞瘤细胞系SH?SY5Y中，用BAPTA降低细胞内Ca2+可通过HIF脯氨酰羟化酶的抑制,诱导HIF?1α蛋白的蓄积和HIF?1依赖基因的表达。我们研究也发现，常氧时，在SGC7901胃癌细胞中，采用BAPTA降低细胞内Ca2+水平，不仅能增加HIF?1α的蛋白表达、促进HIF?1α的转位，而且能使HIF?1的转录活性增加、HIF?1调节基因VEGF的分泌增多，该结果与Berchner等的报道非常相似，提示BAPTA可能也是通过对脯氨酰羟化酶的抑制而促进HIF?1α的稳定。Liu等[10]在最新的研究中表明， 在常氧和缺氧的HepG2细胞中， Ca2+的离子载体A23187和细胞内钙的的螯合剂BAPTA均能诱导Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子(plasminogen activator inhibitor?1, PAI?1)的mRNA和蛋白表达， 但两者对HIF?1α的调节并不相同； A23187诱导的是明显和持久的HIF?1α的增加， BAPTA介导是快速和瞬间的增高； A23187诱导的是HIF?1α的mRNA表达， 而BAPTA 作用于转录后水平； A23187通过ERK途径致HIF?1α的增强， 而BAPTA则是通过HIF?脯氨酰羟化酶活性和VHL作用的抑制而发挥作用。 我们研究发现， 常氧时， Ca2+ 的离子载体Ionomycin也有微弱和短暂的增加HIF?1α蛋白稳定， 促HIF?1α转位功能， 但不足以引发HIF?1转录活性的增强和HIF?1调节基因VEGF分泌的增加； 相反， BAPTA却表现出明显和比较持久的HIF?1α蛋白表达的增加和HIF?1转录活性的增强。 提示细胞内Ca2+的升高虽然也能影响HIF?1α的蛋白表达， 但细胞内Ca2+水平的降低似乎在胃癌细胞的缺氧调节中发挥了更重要的作用。 该结果与报道并不完全吻合， 其可能原因为： （1）在不同肿瘤细胞中， 缺氧后的反应及缺氧调节的信号通路可能并不完全一致； （2）虽然Ionomycin 和A23187在Ca2+的转运方面存在很大相似性， 但两者对二价阳离子的转运能力可能并不完全相同[11]， 因而导致了细胞缺氧反应的不同； （3）不同实验条件如培养液中血清浓度、 pH值及药物诱导时间的不同等， 可能也与实验结果的不完全一致有关。 总之，我们的研究表明螯合细胞内钙可诱导HIF?1的转录激活，提示细胞内游离钙可能在胃癌细胞缺氧信号转导过程中发挥了重要作用，但还需进一步的研究以确定其具体的分子机制。
【文献】
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