三氧化二砷对阿霉素耐药的白血病细胞血管新生相关因子的影响
作者：陈牧 张建东 张育 王晓铃 沈维干 李国青
【摘要】 目的探讨三氧化二砷(arsenic trioxide, As2O3)对白血病耐药细胞株K562/A02细胞血管新生相关因子血管内皮生长因子（VEGF）表达水平及基质金属蛋白酶2、9（MMP?2、9）活性的影响。 方法用噻唑蓝法(MTT)测定As2O3对K562/A02细胞的增殖抑制作用，用酶联免疫吸附试验测定细胞上清中VEGF含量，用明胶酶谱法半定量测定细胞上清中MMP?2、9的活性。 结果K562/A02细胞的IC50是（1.64±0.16）μM，0.05μM As2O3对细胞增殖和VEGF的表达没有明显影响，对MMP?2、9的活性在24、48h无明显影响(P>0.05)，但在72h则对MMP?2、9的活性有明显抑制作用(P<0.05)；0.4和3.2μM As2O3可显著抑制细胞增殖，下调VEGF并使MMP?2、9活性减弱(P<0.05)。结论As2O3可能通过下调VEGF的表达和抑制MMP?2、9活性而发挥抗白血病细胞血管新生作用。
【关键词】 三氧化二砷； 血管内皮生长因子； 基质金属蛋白酶； 明胶酶谱
Effect of Arsenic Trioxide on Related Factors of Angiogenesis in K562/A02 Cells
Abstract：Objective To investigate the effect of arsenic trioxide (As2O3) on the expression of VEGF and the activity of MMP?2 and 9 in K562/A02 cells. MethodsMTT assay was used to detect the inhibition ratio of K562/A02 cell. Enzyme?linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the level of VEGF. Gelatin zymography assay was used to assess the activity of MMP?2, 9. ResultsNeither the proliferation nor VEGF expression of K562/A02 cells was influenced by 0.05μM As2O3 after 24, 48 and 72 hours’ incubation. The activities of MMP?2, 9 were not effected after 24, 48 hours’ incubation with 0.05μM As2O3 (P>0.05), but they were significantly inhibited after 72 hours (P<0.05). 0.4 and 3.2μM As2O3 highly inhibited the proliferation, down regulated VEGF expression and inhibited the activity of MMP?2, 9 of K562/A02 cells (P<0.05). ConclusionThe possible mechanism of anti?leukemic angiogenesis by As2O3 may be achieved by inhibiting the expression of VEGF and the activity of MMP?2 and 9.
Key words：Arsenic trioxide;VEGF; MMP;Gelatin zymography assay
0引言
肿瘤细胞的多药耐药(Multidrug resistance, MDR)是导致临床白血病患者化疗失败的常见原因。 造成肿瘤细胞MDR的因素众多， 其中血管新生(Angiogenesis)与肿瘤多药耐药的关系正逐渐受到越来越多的重视。 肿瘤血管新生不仅是白血病发生、 和浸润的重要条件， 而且其相关因子， 如血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor， VEGF)和基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase， MMP)所具有的复杂的生物学效应也直接或间接增强了肿瘤细胞的MDR[1, 2]。 因此， 如果能有效下调多药耐药细胞表达的血管新生相关因子， 无论从肿瘤的血管新生还是多药耐药均具有积极意义。 本文即以白血病多药耐药细胞株K562/A02细胞为研究对象， 通过对不同浓度三氧化二砷（Arsenic trioxide， As2O3）处理K562/A02细胞24、 48和72h后VEGF表达水平及MMP?2、 9活性变化情况的研究， 进一步阐明了As2O3对多药耐药细胞株K562/A02的VEGF和MMP?2、 9的调控作用。
1材料和方法
1.1药物配制As2O3用1mM的NaOH溶液溶解并配成12.8mM贮备液，4℃贮存。实验前用培养基稀释成0、0.05、0.4和3.2μM 4个浓度。
1.2细胞培养K562/A02白血病耐药细胞株购自医学院天津血液学研究所，接种于RPMI?1640培养基(含10%小牛血清，100Ｕ/ｍl青霉素, 100μg/ｍl链霉素)，用浓度为2μg/ml的阿霉素以维持细胞耐药性，于37℃、5% CO2、饱和湿度环境下常规培养。实验时提前两周停用阿霉素。
1.3MTT法测定As2O3对K562/A02增殖抑制作用取对数生长期细胞， 以 1×105/ml的浓度接种于96孔板， 培养24h后离心去上清， 加入不同浓度As2O3含药培养基， 孵育72h后用MTT法检测570nm处吸光度， 并细胞增殖抑制率。 抑制率=(1-加药组OD值/对照组OD值)×100%。
1.4ELISA测定细胞上清中VEGF含量细胞接种于24孔板， 培养方法同上， 经不同浓度As2O3含药培养基孵育24、48和72h后收获细胞及上清。 VEGF检测过程按试剂盒(博士德生物工程有限公司)说明书操作， 在450nm处测定OD值并绘制标准曲线。 每组设3个复孔， 实验重复3次。
1.5MMP?2、9活性用明胶酶谱法检测实验方法：取对数生长期细胞，用培养基调整为2×105/ml，接种于24孔板，培养24h后离心去上清，加入不同浓度As2O3孵育24、48、72h后收获上清。用Lowry’s法测定细胞上清蛋白浓度，并将上样蛋白量调整为70μg/18μl，与1/6体积的上样缓冲液混合孵育30min，上样于含0.8%明胶的8%聚丙烯酰胺凝胶中进行垂直电泳，初始电压80V，待溴酚蓝至分离胶后加至150V。电泳结束后，将凝胶依次置于洗脱液中(25g/L TritonX?100，50mM Tris?HCl，5mM CaCl2，1μM ZnCl2，pH 8.0)中振荡洗脱45min×3次；漂洗液中(不含TritonX?100的洗脱液)振荡漂洗20min×3次，孵育液中(0.1M甘氨酸，50mM Tris?HCl，5mM CaCl2，1μmol/L ZnCl2，0.5M NaCl，pH 8.0)37℃恒温低速振荡孵育48h。用考马斯亮蓝染液(0.1%考马斯亮蓝R?250，甲醇300ml，冰醋酸100ml，蒸馏水450ml)染色1.5h，脱色液(30%甲醇，10%醋酸)脱色至阳性条带清晰且背景对比度适宜时取出凝胶，经成像后即可对其进行半定量分析。结果评价：电泳后负染带亮度的强弱和面积大小可以半定量地表征明胶酶的活性大小。金属蛋白酶活性评分方案在孙晓敏等[3]的评分法基础上有所改进，即：“0”分，条带勉强可辨或未见任何条带；“1”分，条带边缘及中央模糊，但可辨认，宽度小于1mm；“2”分，条带边缘锐利且中央清晰，宽度小于1mm；“3”分，条带边缘模糊但中央清晰，宽度1～2mm；“4”分，条带边缘锐利且中央清晰，宽度1～2mm。
1.6数据统计方法 IC50及ELISA实验数据用±s表示。组间数据比较采用t检验和one way ANOVA, P<0.05认为有统计学意义，用SPSS10.0软件进行统计学分析。
2结果
2.1As2O3对K562/A02细胞的增殖抑制作用As2O3孵育K562/A02细胞72h后，MTT法测得IC50是(1.64±0.16)μM。0.05μM As2O3对K562/A02细胞的抑制率为－0.64%，可轻微促进细胞增殖，但无统计学意义(P>0.05)；0.4和3.2μM As2O3则对K562/A02细胞增殖的抑制率分别为25.1%和64.4%，表现为明显的抑制作用(P<0.05)。
2.2As2O3对K562/A02表达VEGF的抑制作用ELISA法检测VEGF的标准曲线回归率为99.8%。结果显示：0.05μM As2O3处理K562/A02细胞24、48和72h后，与对照组（0.00μm)相比，VEGF出现轻微上调，但该结果无统计学意义(P>0.05)。0.4μM和3.2μM As2O3在作用24、48、72h后对VEGF均有明显下调作用(P<0.05)。在相同时段，3.2μM As2O3相对其它浓度As2O3对VEGF的下调作用也更为显著，见表1。
表1As2O3对K562/A02细胞VEGF表达的影响（略）
注：*与对照组比较P<0.05
2.3As2O3对K562/A02细胞MMP?2、9活性的抑制作用 MMP?2、9凝胶结果见图1，得分结果见表2。细胞上清经电泳、复性等步骤后在凝胶上呈现出明亮的阳性条带，其宽度和亮度反映了MMP?2、9的活性。凝胶结果显示，对照组细胞的MMP?2、9条带在各时段均有表达。MMP?2、9中以MMP?2(72KD)的条带最宽，MMP?9次之，MMP?2(62KD)最窄。从表2可以看出，MMP?2、9在相同情况下受到As2O3抑制的基本趋势是一样的，均表现为随As2O3浓度及作用时间延长而抑制作用逐渐明显。统计学结果显示：①MMP?2、9经0.05μM As2O3处理后在24、48h与对照组比较并无明显差异(P>0.05)，72h差异才具有显著性(P<0.05)，提示0.05μM As2O3在24、48h对MMP?2、9没有明显抑制作用。②MMP?2、9的活性经0.4μM和3.2μM处理后随As2O3浓度增加和作用时间延长而抑制作用也逐渐增强，与对照组比较差异均有显著性(P<0.05)。
图1As2O3对MMP?2、9活性的影响（略）
表2MMP?2、9的分值(平均值)比较（略）
注：*与对照组比较P<0.05
3讨论
As2O3是中药砒霜的主要成份，近年来发现它不仅具有抑制肿瘤细胞增生、促进其凋亡等作用，还能有效下调肿瘤的血管新生。采用抗血管新生方案处理后的肿瘤细胞，其迁移能力以及耐药性均有不同程度的降低。可见，抗肿瘤血管新生策略作为白血病的一种思路，与传统的化疗、放疗等手段相结合应用，对控制疾病的、提高缓解率、延长患者的生存期均有积极意义。我们在实验中发现， 0.4和3.2μM As2O3对K562/A02细胞有明显增殖抑制作用， 其IC50为（1.64±0.16）μM， 与相关报道一致[4]。 费嘉等[5]用VEGF反义核酸研究发现， VEGF与肿瘤细胞的增殖关系密切。 在本课题中， 我们对As2O3处理K562/A02细胞后VEGF的变化情况也进行了研究。 结果显示， 0.4和3.2μM As2O3处理K562/A02细胞后， 随时间延长VEGF表达明显下调； 对不同浓度As2O3处理相同时间后收获的上清检测亦发现， 随As2O3浓度增加， VEGF的表达逐渐下调。 白血病细胞髓外浸润是造成肿瘤病人死亡的重要原因，该过程与蛋白水解酶降解胞外基质密切相关。MMP?2和MMP?9属于基质金属蛋白酶家族中的明胶酶，其主要生物学作用是水解胞外基质和促进新生血管的形成，它们对白血病髓外浸润有重要的病意义。我们研究已发现As2O3可以有效抑制K562/S细胞MMP?2、MMP?9 的活性,其作用的强度与剂量及作用时间有关[6]。为了进一步探讨As2O3对白血病耐药细胞株MMP?2、9活性的影响，本课题选用明胶酶谱法对As2O3处理后的K562/A02细胞上清中MMP?2、9的活性变化情况进行了进一步的研究。结果显示，MMP?2、9在K562/A02细胞均有表达，这一结果与既往报道相似[7, 8]。从图1中可以看到，条带中以MMP?2(72KD)最宽，MMP?9次之，MMP?2(62KD)则最窄。MMP?2、9活性随As2O3浓度增加及作用时间延长而受到的抑制也逐渐增强。但0.05μM As2O3将细胞孵育24和48h后与对照组比较差异并不明显，提示0.05μM As2O3对MMP?2、9在短时间内可能无明显抑制作用。但72h后即可观察到0.05μM As2O3对MMP?2、9条带有一定程度的抑制。目前证实，VEGF水平与MMPs的表达存在调节关系[9]。MMPs与VEGF基因共同的上游调控因子，如NF?κB、AP?1和Ets等，可以促进VEGF和MMPs表达[10?12]。已有研究表明，VEGF可使内皮细胞表达Ets量显著增加[13]。另外，不同的细胞系培养研究发现，VEGF不仅可通过Ets?1调节MMP?9启动子而上调MMP?9 mRNA的表达，还通过转录因子ELAF调节MMP?2启动子。由此可知，VEGF、MMPs及Ets?1、ELAF间存在相辅相成的关系，提示若VEGF浓度出现波动则有可能对MMPs的表达产生影响。本实验结果显示，一定浓度的As2O3不仅可下调K562/A02细胞VEGF的表达，而且可降低MMP?2、9的活性。最近研究发现As2O3可通过下调NF?κB的表达而抑制MMP的表达[14]。As2O3对MMPs 的抑制是否与其下调VEGF的表达有关，是否存在其他通路，尚有待于进一步的研究。本课题实验结果提示，As2O3在0.4μM和3.2μM浓度时可有效地下调白血病多药耐药细胞株K562/A02 VEGF的表达及MMP?2、9的活性。As2O3对VEGF的下调作用及对MMP?2、9活性的抑制作用可能是其抑制血液病肿瘤细胞血管新生的原因之一。
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