Hedghog信号通路与肿瘤发生

【关键词】  Hedgehog Signaling Pathway Patched Smoothened Cubitus interruptus Gli

　　0  引言

    Hh是由“刺猬”(hedgehog)简写而来的。这类基因最早是在果蝇里发现，果蝇和其他动物一样身体分成多个节段，幼虫的每个节段内一部分有毛、一部分无毛，Hh基因突变使无毛部分变成有毛部分，所以被戏称为“刺猬”基因。果蝇Hh基因是美国霍普金斯大学毕淇实验室在90年代初克隆的，在果蝇只有一个Hh基因，以后多个实验室在高等动物发现有三个Hh基因。Hedgehog通路不仅在胚胎正常发育中起着重要作用，通路的异常还可引发畸形和肿瘤。本文就Hedgehog通路的构成、途径及在胚胎发育和肿瘤形成中的作用、肿瘤的进展进行综述。

    1  Hedgehog通路的基本构成

    1.1  Hedgehog蛋白家族

    果蝇只有一个hedgehog基因，脊椎动物有3种hedgehog基因，包括：Desert hedgehog(Dhh), Indian hedgehog(Ihh), Sonic hedgehog(SHh)。Dhh与果蝇的Hedgehog基因的关系最近；Ihh和SHh之间的关系较近。

    Hedgehog蛋白是一种分泌蛋白，必须经过自身的修饰才能获得活性。 Hh蛋白包含一个N端信号结构域，和一个C端催化结构域。C端催化结构域可以共价结合胆固醇，并使其结合到N端信号结构域，再将N端信号结构域一个半胱氨酸棕榈酰化，这个过程需要Skinny hedgehog酰基转移酶。从鸡的sonic hedgehog (SHh)蛋白出发,用BLAST法找到其在人、小鼠、大鼠等脊椎动物的同源蛋白共16个,组成Hedgehog蛋白家族。

    1.2  Patched(Ptch)蛋白

    Ptch蛋白是细胞表面接受Hh信号蛋白的受体， 具有二种功能， 一是与Hh结合， 二是抑制Smoothened(Smo)。 在人类中Patched基因有两个同源基因， Ptch1、 Ptch2， 分别编码Ptch1、 Ptch2蛋白。 Ptch2细胞内的氨基和羧基端结构域与Ptch1不同， 包括在羧基端区域缺少150个氨基酸残基。

    1.3  Smoothened（Smo）蛋白

    Smo基因编码一个有1024个氨基酸组成的蛋白质，它的作用是Hh信号的转换器。Smo蛋白有7个疏水跨膜区，1个细胞外氨基端区域和1个细胞内的羧基端区域。Smo蛋白具有一些与G结合蛋白受体的相似性，与蜿蜒蛋白的Frizzled家族有同源性。当没有Hh蛋白时，Ptch通过下游信号抑制Smo。当Hh蛋白结合到Ptch时，Smo可以上调下游基因表达[1]。

    1.4  Patched和Smoothened之间的关系

    关于Patched和Smoothened(Smo)之间关系有四种解释: (1) Ptch通过下游信号抑制Smo。Hh蛋白与Ptch结合通过构象改变减轻了对Smo的抑制，使之可以调整下游信号。(2) 假设是Hh通过引起Ptch/Smo复合体分裂来激活Smo。(3) Ptch通过一种可播散的媒介来抑制Smo，Hh结合到Ptch后改变了媒介的活性，使Smo激活。(4) Ptch通过一种小分子物质催化来抑制Smo，Hh结合Ptch后，Smo与Ptch和小分子物质分离从而被激活[2]。

    1.5  Cubitus interruptus(Ci)和Gli蛋白，Costal 2(Cos2)蛋白，Fused(Fu)激酶，Suppressor of Fused(Sufu)的复合体

    在果蝇中具有锌指结构的Cubitus interruptus(Ci)基因是脊椎动物中Gli基因家族的同源基因，它们所编码的蛋白在Hh通路中起着关键作用。

    Ci是一种155kDa有5个锌指结构的蛋白质。它有两种形式，一种是截去75kDa的抑制剂，另一种是全长155kDa的催化剂。结构上有Sufu结合区(SF)，锌指DNA结合区(ZF)，核定位信号(NLS)，分裂点，核输出信号(NES)，磷酸化点(P)，Costal2(Cos2)结合区(CORD)，CREB结合蛋白区(CBP)。将155kDa的Ci水解成75kDa的Ci需要将Ci磷酸化。

    Gli基因家族最初是在人类恶性胶质瘤中扩增GLI1时被确认的。 GLI1、 GLI2、 GLI3均有5个保守的锌指结构， 锌指间由组氨酸?半胱氨酸连接。 在脊椎动物中三种不同的Gli蛋白代替了果蝇中的Ci蛋白， 这样可以在目标区域产生更为复杂的反应。

    Ci或Gli与Costal 2(Cos2)蛋白，Fused(Fu)激酶，Suppressor of Fused(Sufu)蛋白在细胞内组成复合体。当Patch失去对Smo的抑制作用后，Smo为复合体提供磷酸，促使Ci或Gli转变成催化剂形式，进入细胞核启动下游基因转录。相反如果Smo受到抑制，Ci或Gli的抑制剂形式将在细胞核中阻止基因的转录[3]。

    1.6  目的基因

    Hedgehog通路的目的基因在不同的物种中有所不同，果蝇的目的基因包括Ptch、Wingless(Wg)、Decapentaplegic(Dpp)。这些基因相当于脊椎动物的Ptch、Wnt家族和TGFβ超级家族的骨发生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins,BMPs）；他们是正常胚胎发育和分化的基础。

    2  Hedgehog通路的调控

    Hedgehog蛋白是整个通路的启动因子，Patched(Ptch)是Hedgehog的受体，可和Hedgehog结合。Smoothened(Smo)是信号转导子。当没有Hedgehog时，Ptch抑制Smo。这种抑制最终使一种转录因子成为转录抑制子。该转录因子在果蝇中称为Cubitus interruptus(Ci), 在脊椎动物中称为Gli，抑制目的基因的表达。Gli一共有三型，每一种都有独特的转录功能。当Hedgehog和Ptch结合时，则Smo抑制解除，Ci/Gli进入胞核，作为同一基因的转录激活因子发挥作用，激活目的基因的表达，见图1。对脊椎动物的研究表明, SHh通路对细胞命运的决定是通过调节多种Gli基因表达的组合完成的。

    图1  Hedgehog通路示意图

    3  Hedgehog通路在胚胎发育中的作用

    Hedgehog信号通路在胚胎早期发育中发挥重要作用。目前SHh的功能研究的最清楚，在发育中起许多关键作用，包括神经系统中线形成、眼睛发育、小脑细胞分裂。IHh和DHh研究的较少。IHh调节软骨等组织的发育；DHh功能为调控精细胞发育。

    SHh信号在脊索的维持、基板(floorplate)和运动神经元的诱导、轴骨的诱导以及远侧肢的发育都是必需的。因为SHh从前索中胚层分泌，通常抑制眼原基中心眼的形成，因此当该信号有缺失时，就会导致单眼症。

    SHh在人类发育中的重要性是在SHh突变导致前脑无裂畸形（holoprosencephaly）的发现中表现出来。前脑无裂畸形是一种发育缺陷性疾病，对面部和神经系统的中线产生影响。表现为耳低位，双侧唇裂及腭裂、单中央门齿、缺陷性中央神经系统分隔,小头、眼异常、眼间距缩短、智力发育迟缓、耳聋、惊厥及室间隔缺损，一些严重的病例甚至有单眼症。类似和一些其他表型在SHh遭到破坏的小鼠上也观察到了，老鼠的目的基因被打断后导致独眼畸形和腹侧神经管细胞缺失。SHh突变是隐性的，呈现很多种类型。与老鼠相比，人类的SHh突变是杂合型，前脑无裂畸形的表现形式更多。表1  已知的有关人类部分肿瘤与hedgehog通路中突变的关系

    4  Hedgehog与肿瘤发生的关系

    Hh通路中某一部分发生突变，可能引起致命的后果或发生癌变。已知的有关人类部分肿瘤与hedgehog通路中突变的关系， 见表1。

    Hh通路中的突变在一些肿瘤中被确认， 但突变与肿瘤发生的具体关系仍不清楚，令人感兴趣的是某些肿瘤的生长可以特异的被通路阻断剂所抑制，这个发现给肿瘤的基础研究和临床应用带来了新的希望。

    人类PTCH是一种肿瘤抑制基因，定位在9q22.3，Ptch突变在痣样基底细胞癌综合征、单发基底细胞癌、髓母细胞瘤、脑膜瘤、神经外胚瘤，乳腺癌、食管癌、鳞状细胞癌和毛发上皮瘤等病例中均被发现[4]。现在报道最多的是基底细胞癌与Hedgehog通路的关系，PTCH1基因突变导致HH通路靶基因表达及突变与基底细胞癌的关系已十分清楚[5]。大部分突变导致蛋白断裂。四种罕见的Ptch错义突变导致前脑无裂畸形，有两种影响细胞外环，SHh结合位点；另外两种影响细胞内环，可能影响Ptch-Smo的相互作用。PTCH1失功能突变在人类的基底细胞瘤中激活Sonic hedgehog通路。转染失活Ptch1基因小鼠的肿瘤发生率升高，且对辐射极其敏感[6]。

    目前研究较多的髓母细胞瘤，是一种高发于儿童的恶性肿瘤，研究表明功能性Ptch等位基因的沉默是通路激活和肿瘤发生的关键。突变Ptch蛋白对Smo失去正常的抑制作用，导致Hh通路非正常的激活。在多例髓母细胞瘤标本和细胞系中均发现突变的Ptch基因。一种植物源性的Hh通路阻滞剂环杷明（cyclopamine），能够阻断Smo的活性，从而阻断通路的激活，在细胞实验和动物活体实验中均能抑制髓母细胞瘤的生长,且未观察到对其它细胞生长和实验动物的不良影响[7]。Gli作为Hh通路的下游因子，也影响着肿瘤的发生，封闭Gli基因后，肿瘤的生长受到明显抑制[8]。以上研究说明髓母细胞瘤的发生确与Hh通路有关，Hh通路的各个结点均有望成为肿瘤的突破点。

    Sonic Hedgehog蛋白在胰腺癌及胰腺上皮瘤样病变中异常表达，在胰腺癌细胞系和原代培养中异常表达。在活体和细胞实验中，通过cyclopamine或其它方式阻断Hh通路均能诱导凋亡和阻断肿瘤细胞分裂[9]。Human Hedgehog interacting protein (HHIP)是Hh通路的负调控因子，已被证明它的启动子在13/17 (80%)的胰腺癌细胞系中，35/75 (46%)的原发胰腺癌中，14/18 (78%)胰腺癌转移物中被甲基化，从而导致HHIP表达过低，而正常胰腺组织没有这种现象[10]。

    遗传分析证明HH通路在乳腺形成中起重要作用，破坏PTCH1使乳腺管异常生长。Kubo等[11]用免疫组织化学方法测定了52名乳腺癌患者的Sonic Hh、PATCH1 and GLI1等成分。所有肿瘤组织的浓度的GLI1都较其周围正常组织高。GLI1的核染色率与其雌激素受体的表达和组织分型有关。Cyclopamine可以抑制GLI1的表达和依赖HH通路激活的乳腺癌细胞的生长[11]。

    Hedgehog通路的激活发生在多数前列腺癌患者中。Sheng等检测了27例前列腺癌标本，发现11/27的PTCH1阳性的肿瘤中检测不到Sufu，其中有2例有Sufu的失功能突变。另外在大多数（24/27）PTCH1阳性的肿瘤中检测到Sonic Hedgehog蛋白的表达。高水平的HH通路靶基因表达也在四种前列腺癌细胞系（TSU、 DU145、 LN?Cap and PC3）中发现。他们证明通过Smo抑制剂cyclopamine抑制HH通路，下调了细胞的侵袭力，也可以诱导凋亡。癌细胞在CMV启动子引导下可以抵抗cyclopamine介导的凋亡[12]。

    前列腺癌中HH通路的表达强于正常前列腺上皮，cyclopamine可以抑制GLI1+/PSA+的原代培养物的分裂。SHH可以增强肿瘤细胞的分裂，提示：自分泌可以促进肿瘤的生长。另外通过cyclopamine或GLI1的RNA干涉可以阻断3种前列腺癌细胞株的分裂[13]。

    5  展望

    通过对肿瘤的多年研究，人们已经注意到一些肿瘤的生长与胚胎发育有着相似性，目前对部分肿瘤的研究已确认了这一点，随着研究的深入可能发现更多的相关肿瘤。Hedhehog通路的研究，可以加深我们对胚胎发育的调控机制的认识，探索各种因素对基因、蛋白表达的影响。Hedgehog通路与肿瘤相关的研究，为肿瘤研究开辟新的途径，有望查明一部分肿瘤的发生机制，发现一些肿瘤特异性蛋白，通路中的多个结点，运用多种方法阻断后，均能影响肿瘤细胞的生长，几种特异性蛋白也在肿瘤中发现，这些研究对临床工作中肿瘤的早期发现、及针对性治疗具有指导意义。

【】
  ［1］ Alcedo J,Ayzenzon M,Von Ohlen T, et al. The Drosophila smoothened gene encodes seven-pass membrane protein,a putative receptor for hedgehog signal［J］. Cell,1996,86(2):221?232.

/[2/] Cohen MM Jr.The hedgehog signaling network［J］.Am J Med Genet,2003, 123A(1):5?28.

/[3/] Nybakken K,Perrimon N.Hedgehog signal transduction:recent findings［J］. Curr Opin Genet Dev,2002,12(5):503?511.

/[4/] Cohen MM Jr.Nevoid basal cell carcinoma syndrome:molecular biology and new hypotheses［J］. Int J Oral Maxillofac Surg,1999,28(3):216?223.

/[5/] Agren M, Kogerman P, Kleman MI, et al. Expression of the PTCH1 tumor suppressor gene is regulated by alternative promoters and a single functional Gli?binding site［J］. Gene， 2004，330:101?114.

/[6/] Mancuso M, Pazzaglia S, Tanori M, et al. Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1?deficient mice［J］. Cancer Res， 2004，164(3):934?941.

/[7/] David M Berman,Sunil S karhadkar,Anirban Maitra,et al.Widespread requirement for Hedgehog ligand stimulation in growth of digestive tract tumours［J］. Nature, 2003,425(6960):846?851.

/[8/] Kimura H, Stephen D, Joyner A，et al. Gli1 is important for medulloblastoma formation in Ptc1+/- mice［J］. Oncogene，2005, 24(25):4026?4036.

/[9/] Thayer SP, di Magliano MP, Heiser PW, et al. Hedgehog is an early and late mediator of pancreatic cancer tumorigenesis［J］． Nature， 2003,425(6960):851?856.

/[10/] Martin ST, Sato N, Dhara S，et al. Aberrant Methylation of the Human Hedgehog Interacting Protein (HHIP) Gene in Pancreatic Neoplasms［J］. Cancer Biol Ther， 2005, 4(7):728?733.

/[1１/]Kubo M, Nakamura M, Tasaki A, et al. Hedgehog signaling pathway is a new therapeutic target for patients with breast cancer［J］. Cancer Res， 2004,64(17):6071?6074.

/[1２/]Sheng T, Li C, Zhang X, et al. Activation of the hedgehog pathway in advanced prostate cancer［J］. Mol Cancer， 2004, 3(1):29.

/[1３/]Pilar S, Ana MH, Barbara S, et al. Inhibition of prostate cancer proliferation by interference with SONIC HEDGEHOG?GLI1 signaling［J］. Dev Bio， 2004, 101(34):12561?12566.