新城疫病毒对血管生长的抑制作用

【摘要】  目的 研究鸡新城疫病毒对血管的生长抑制作用。方法 采用小鼠肺癌转移模型观测鸡新城疫病毒（NDV）对癌细胞转移的影响及组织内微血管的生长情况；用体外药物敏感实验（MTT）检测NDV在不同剂量和作用时间下对人血管内皮细胞ECV304细胞的增殖抑制效应；用PI和Hoechst33342进行荧光染色检测NDV作用后细胞有无凋亡改变及其形态学变化。结果 NDV在体内可以有效抑制小鼠发生癌转移时组织内微血管的生成，在体外可以抑制ECV304细胞的增殖并导致较为轻微的凋亡现象。结论 体内外实验均表明NDV可以抑制肿瘤发生时微血管的生长，这一作用通过抑制血管内皮细胞的增殖而非直接的细胞毒作用实现，该作用机制可能与某种特定病毒蛋白有关，尚待进一步研究。

【关键词】  NDV； 血管生成抑制剂； 肺转移

    Growth Inhibition of Newcastle Disease Virus(NDV) on Vein

     Key words：NDV; Angiogenesis inhibitor; Pulmonary metastasis

    肿瘤生长依赖从生长环境中获得营养并向环境排泄代谢产物，当肿瘤细胞的量较为少时，其与环境之间的物质交换可以通过弥散的方式来完成，但是，当肿瘤组织增大到一定程度时，物质交换就需要通过其间的血管网来完成。研究表明，肿瘤组织的增长速度与其对血液供应的依赖性成正比。因此，从理论上来说，通过抑制血管生长进而阻断肿瘤的血供，可以达到抑制肿瘤增长及转移的目的。大量研究表明，鸡新城疫病毒可以通过直接的细胞毒作用和对肿瘤细胞凋亡的诱导作用起到抗肿瘤效果[1]。本研究通过体内、体外两种方法探讨了鸡新城疫病毒对血管生长的抑制作用，进一步揭示了鸡新城疫病毒抗肿瘤作用的机理。

    1  材料和方法

    1.1  实验材料

    新城疫病毒NDV（Lasoda株，冻干疫苗，华中农业大学动物医学学院）；昆明种小鼠，体重(20±1)g，由华中科技大学实验动物中心提供；细胞株：人脐静脉内皮细胞株ECV304由华中科技大学公共卫生学院赠送，小鼠S?180 细胞株由本实验室传代培养，均用含10%胎牛血清、100u/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI?1640培养基，在37℃5%CO2的培养箱中培养；试剂：RPMI?1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均为Gibco产品；四甲基偶氮盐（3?[4，5?dimethyl?2?thiazoly1]?2,5?diphenyl?tetrazolium bromide）、Hoechest33342、碘化丙啶（Propidium Iodide）均为Sigma产品； HPIAS?1000高清晰度彩色病理图文分析系统（清屏影像技术有限公司）

    1.2  实验方法

    1.2.1  病毒的复壮与收集将新城疫病毒Lasoda株活疫苗（NDV?L）接种于9日龄鸡胚尿囊腔培养48～72h，收集尿囊液，测得血凝效价为1∶640，分装于无菌离心管中，-20℃保存。

    1.2.2  肺转移动物模型的建立取接种7天左右的种鼠，颈椎脱臼处死后抽取腹水，用生理盐水稀释至2.5×106/mL。经尾静脉注射接种瘤细胞，每鼠0.2mL[2]。

    1.2.3  抗肿瘤转移实验将接种后的小鼠随机分为空白对照组及组，每组10只。接种后24小时起腹腔给药（血凝效价1∶640，0.2mL/只），每3天给药一次，对照组给等量PH7.2的PBS，共给药5次。接种后第15天颈椎脱臼处死小鼠，解剖取肺并检查有无其他脏器及部位的转移。肺组织常规固定、包埋、切取最大截面计数转移灶数，并观察肺组织内血管的生长情况。

    1.2.4  MTT法检测NDV对人血管内皮细胞ECV304的作用取对数生长期细胞用含10%胎牛血清的RPMI?1640培养基稀释为2×106/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，之后依次加入用PH7.2的PBS10倍梯度稀释的NDV和阴性对照组，并保留仅加培养基的空白组。随后在37℃5%CO2的培养箱中连续培养24h、36h，然后每孔加入10μL 5mg/mL的MTT 溶液，连续培养4小时。吸去上清，每孔加入100μL DMSO，在570nm波长处用酶标仪测OD值。用下面的公式细胞增殖抑制率[3]：细胞增殖抑制率=OD空白-OD样品OD空白×100%

    1.2.5  荧光显微镜检测药物对ECV304细胞核形态学特征的影响分别将Hoechst33342和碘化丙啶（PI）配成100μg/mL的母液，用前等量混合。细胞经1∶4NDV处理16h、24h、48h后分组收集。每个标本取200μL移入EP管中，加入荧光染料Hoechst33342至终浓度10μg/mL，碘化丙啶（PI）20μg/mL，37℃下染色15min，取20μL细胞悬液迅速滴于载玻片上，加盖玻片，紫外光激发，在荧光显微镜下观察可见4种细胞形态，活细胞（VN）染为蓝色，核呈正常结构；早期凋亡细胞（VA）染为蓝色，核呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞（NVN）染为红色，核呈正常结构；晚期凋亡细胞（NVA）也染为红色，但可见明显的染色质凝聚，细胞凋亡率可由以下公式计算[4]：

    凋亡率=VA+NVAVN+NVN+VA+NVA×100%

    2  结果

    2.1  鸡新城疫病毒对小鼠肺血管生成的影响S180肉瘤尾静脉内接种以形成肺转移灶为主，亦有其他部位的转移。10只对照组小鼠肺表面及肺内均出现直径0.5～2.0mm的粒状转移灶，肺组织颜色深红，有明显的充血症状（图略），其中出现胸膜黏连3只，腹膜、腋下转移性包块2只。组肺组织发白，除2只肉眼可见极小的转移灶外，其余均为镜下转移灶（图略）。光镜下S180肉瘤实验性肺转移对照组的转移灶内及周围血供丰富，瘤细胞密集，生长旺盛，有明显的血管增生扩张、充血和出血，一些血管腔内有从转移灶侵入的瘤细胞。并见大片坏死区，见图1，此外，对照组肝脏也可见少量散在的转移灶。NDV组小鼠肺内也见散在的小转移灶，其中有散在的凋亡细胞。未见血管扩张、充血，无血管长入，组织内血管细、少、闭锁，亦未见成片的坏死灶，见图2。

    2.2  MTT法观察NDV对血管内皮细胞ECV304的影响各浓度NDV对人血管内皮细胞ECV304的增殖均有抑制作用，且呈良好的时间量效关系，结果见表1，治疗组细胞生长抑制率同对照组的抑制率比较有极显著差异（P＜0.01）。表1  MTT法观察鸡新城疫病毒对人血管内皮细胞ECV304增殖的抑制作用与空白组比较 :P<0.05；**与空白组比较:P<0.012.3  荧光显微镜检测细胞核变化在荧光显微镜下，可以观察到存活细胞和凋亡早、晚期及坏死的细胞。药物作用0、12、24、48h其凋亡率分别为0.5%、4%、6% 、11%，随诱导时间的延长，凋亡率增高，呈时间依赖关系，见表2。统计表明，NDV组第12、24、48小时时间段凋亡率与阴性组相比虽然表现为不同程度的增加，但均未见显著性差异。镜下观察发现给药组随作用时间的延长，其与空白组相比细胞密度的降低并不主要表现为死亡细胞的增加，而是NDV抑制细胞增殖的结果，见图3。

    3  讨论

    以血管生成的各个环节及其发生过程中的生化改变为靶点，研制血管生成抑制剂，控制肿瘤生长和转移，已经成为肿瘤防治的一个重要途径。国内外大量研究表明鸡新城疫病毒（NDV）具有抗肿瘤作用。以往的研究认为鸡新城疫病毒主要通过以下机制达到抗肿瘤的效果：（1）对肿瘤细胞的直接细胞毒作用；（2）促进人体产生NO、干扰素、白介素－2等细胞因子从而增强抵抗力；（3）与肿瘤细胞细胞膜结合，增强肿瘤细胞抗原的免疫原性[5]。通过本实验，我们发现鸡新城疫病毒抗肿瘤作用还与其抑制血管生成有关，且该作用主要通过抑制血管内皮细胞的增殖而非直接的细胞毒作用实现，该作用机制可能与某种特定病毒蛋白有关，尚待进一步研究。此外，由于荧光显微镜下可见部分细胞的凋亡现象，因此也不排除其通过诱导血管内皮细胞凋亡实现对血管内皮细胞生长抑制作用的可能性。表2  NDV作用不同时间后ECV304血管内皮细胞生长因子（VPF/VEGF）是目前研究最彻底的血管生成因子。VEGF具有增加微血管的通透性、促进不同来源的内皮细胞分裂增殖和血管构建、促使内皮细胞的迁移等多种作用，是已知的最强的血管通透剂。VEGF选择性地作用于血管内皮细胞膜上的两种Ⅲ型酪氨酸激酶受体flt?1和KDR，通过磷酸肌醇特异性磷酯酶C使胞内IP3浓度升高而发挥作用。研究表明，NDV可以促使人体产生内源性的血管生成抑制剂干扰素α ，进而抑制血管内皮细胞生长因子bFGF及 VEGF生成，起到抑制肿瘤血管生成的作用[6]。这很有可能成为NDV抑制血管内皮细胞生长的机制之一。

    总之，这一发现在临床上具有很大实用意义，它提示在癌症治疗过程中特别是患者术后应用鸡新城疫病毒可以预防肿瘤的复发和转移。当然，对鸡新城疫病毒抑制人血管内皮细胞增殖机制的研究也将是一件很有意义的工作。

【】
  ［1］ Sinkovics JG, Horvath JG. Newcastle disease virus: brief history of its oncolytic strains[J].Clinvirol, 2000,16(1):1?15.

[2] 农小琳，王大章，蒙敏，等.血管生成抑制剂TNP?470 对小鼠肉瘤肺转移模型的影响[J]肿瘤，2002，22（1）：32?34.

[3] 孙波，吴云林，张学军，等.舒林酸和吲哚美辛对人血管内皮细胞ECV304的生长抑制作用[J].肿瘤，2003，23（5）：370?372.

[4] 张均田. 药理实验方法[M]. 北京医科大学协和医科大学联合出版社，1998.2238?2239.

[5] Moses MA，Sudhalter J， Langer R. Identification of an inhibitor of neovascularization from cartilage [J].Science,1990,248(4961):1408.

[6] 赵万洲，韩锐. 肿瘤血管生成抑制剂研究策略及进展[J].中华肿瘤杂志，2000，22（2）：93?95.