食管上皮不典型增生和早期癌血清标志物的初步研究

         作者：刘彬,崔剑峰,刘新伏,陈汶,陈凤,吕宁,潘秦镜，魏文强，乔友林  

【摘要】  目的 寻找筛查食管鳞状上皮细胞癌前病变的方法，为食管癌的早期诊断提供依据。方法 在河南省林州市食管癌高发区，使用食管镜和Lugol 氏碘液染色检查对725人进行筛查研究。所有研究对象,取组织活检，并收集血样。按食管镜病理组织学结果分为正常、食管炎、不典型增生、早期癌，随机抽取84例作为研究对象，用ELISA方法检测血清中部分肿瘤分子标记物的浓度，包括：金属基质蛋白（MMP?9）；组织抑制因子（TIMP?1）;Cu/Zn过氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD）;抗?p53自身抗体(Anti?p53auto?antibody)和可溶血清白细胞?2受体(IL?2sRα)。结果 正常和食管炎组 MMP?9浓度中位数为150ng/ml，四分位距为（80～225）ng/ml；不典型增生和早期癌组中位数为97ng/ml，四分位距为（58～155）ng/ml；两组间浓度差异有统计学意义（P=0.033）。其他4种血清标志物在两组间差异无统计学意义。结论 MMP?9检测对食管鳞状上皮不典型增生筛查有一定意义，但需要进一步研究。

【关键词】  食管肿瘤；癌前病变；横断面调查；血清标志物

    Serum Markers as Predictors of Esophageal Squamous Dysplasia and Early Cancer

      Key words：Esophageal neoplasms;Esophageal squamous dysplasia;Cross?sectional survey;Serum markers

    全世界食管鳞状上皮细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)新发病例数在各类新发癌症中居第8位，但其死亡数在各类癌症死亡中排第6位 [1]。食管鳞状上皮不典型增生是食管鳞状上皮细胞癌的癌前病变[2] ，因此也是食管癌筛查研究对象。河南省林州市是全世界ESCC和贲门腺癌患病率最高的地区之一，男、女性ESCC的发病率都超过了100/（10万·年）[3]，因此林州市是研究早期ESCC防治方法的理想地区。

    1资料和方法

    1.1资料2002年春季，医学院肿瘤研究所在河南省林州市食管癌基地进行现场筛查试验。研究对象来自于该地区3个村的40～65岁非选择性志愿者725名。使用真空抽血管空腹收集血液，离心分离血清后，干冰保存运输到北京并储藏在-80℃的冰箱中备用。

    1.2组织样本采集使用Lugol氏碘染液喷洒在全部食管段，然后行食管内镜检查[4]。在内镜检查过程中，对所有肉眼可见的病变部位（即未染色部位）做单次或若干次直径2.8mm组织学采样。如果没有发现未着色部位或是病变，则取食管中段部位组织。组织样品用95%酒精固定，石蜡包埋，5μm切片，苏木素?伊红染色。除外一少部分为棘皮症或基底细胞增生等研究对象。从725例研究对象中按病理组织学水平分层随机抽取84例（男44例，女40例），使用ELISA方法检测血清中部分肿瘤分子标记物的浓度。

    1.3组织学诊断两个病理医生在不知道研究对象病史情况下单独完成病理片阅读诊断工作，其组织学诊断标准如下[5]：（1）正常：鳞状上皮区域中没有出现其它病变的组织学特征；分化良好的鳞状上皮细胞，胞浆界面清晰，散在分布的淋巴细胞，上皮层内少见压缩的细胞核片段。如果镜下有固有层，通常包含有散在的炎症单核细胞。（2）食管炎：出现以下三条中任何一条者：固有层乳头延伸进入上皮的上三分之一，并伴有基底细胞增生，且超过上皮厚度的15%；嗜中性细胞和嗜伊红细胞出现在上皮层中；嗜伊红细胞出现在固有层中，或者炎症单核细胞的非囊性渗透。（3）食管上皮不典型增生：核不典型变化（扩大，异型性以及浓染），正常细胞极性丧失，不正常组织出现在上皮的下三分之一（轻度不典型增生），下三分之二（中度不典型增生），全层（重度不典型增生）不伴随全层累及和浸润。由于组织发育不良而且有采样大小限制不能被分级的样品被归为无特定意义鳞状上皮不典型增生(NOS)。（4）鳞状细胞癌：鳞状上皮癌细胞浸润到基底膜。

    1.4实验方法用ELISA试剂盒检测血清中标志物的浓度：MMP?9 试剂盒来自CN Biosciences公司，TIMP?1和 IL?2sRα试剂盒来自 R&D Systems Inc公司，Cu/Zn过氧化物歧化酶和抗?p53自身抗体试剂盒来自Oncogene公司。实验过程采用盲法设计。两份完全相同的血清（来自2000年收集的22个当地居民混合血清）作为质控，用于评价本实验的可信性。倍比稀释每个试剂盒提供的标准样品产生标准曲线，使用BIORAD 550 酶标仪的随机软件绘制标准曲线。所有回归方程决定系数r2范围是0.95～0.99。使用标准回归方程实验样品浓度。

    1.5统计分析方法使用散点图描述每种蛋白的浓度分布。由于大多数研究对象的抗?p53自身抗体浓度较低，将其描述为阴性和阳性。使用Pearson相关和Wilcoxon秩和检验方法评价每种分子指标和人群特征的相关关系。并用Kruskal?Wallis方法检验每种分子指标浓度和病理分级的关系。将研究对象按照病理结果分为正常和异常两组，用Wilcoxon秩和检验方法分析两组间浓度差别。STATA SE 8.0软件绘制受试者工作特征曲线（ROC）。所有显著性水平都采用双侧检验结果。

    2结果

    2.1不同病理诊断类型研究对象的人群特征年龄和性别与725例队列相似，见表1。表184例不同病理诊断类型研究对象的人群特征

    2.2MMP?9、TIMP?1、Cu/Zn SOD、抗?p53自身抗体和IL?2sRα分布情况由于大部分样品的抗?p53自身抗体浓度值为0，所以将其视为定性资料（阳性或阴性），它在各级病理组织中的分布为正常53%、食管炎33%、轻度不典型增生36%、中度不典型增生38%、重度不典型增生33%和食管癌43%（P=0.84)，见图1。

    2.3正常和食管炎及不典型增生和食管癌两组5种标志物检测结果只有MMP?9在两组间分布差异有统计学意义。使用STATA SE 8.0软件绘制ROC曲线用于预测不典型增生。曲线下面积为0.36(95%可信区间0.24～0.49)，说明MMP?9预测不典型增生效果不佳。灵敏度、特异度最大值分别为58%、34%。如果将年龄因素也包括在中，MMP?9预测效能会更低,见表2。

    3讨论

    寻找一种能够筛查癌前病变的方法对于食管癌的早期诊断具有重要意义。食管拉网细胞学检查法经过40年的广泛应用，在取得较好效果的同时，也给受检者带来很大痛苦，顺从率敏感度和特异度均 

    ① MMP?9（P=0.09）；② TIMP?1（P=0.21）；③ Cu/Zn SOD（P=0.30）；④ 抗?p53自身抗体（P=0.84）；⑤ IL?2sRα（P=0.40）

    图1部分肿瘤标记物在不同病理级别的分布

    表25种标志物在各级病理组织中的注：*单位ng/ml；# 单位 U /ml ；△单位 pg/ml

    较低[4]。同时也受细胞采集器、取样技术、标本处理方法及细胞学诊断标准等方面的影响。目前，使用食管镜和Lugol氏碘液染色诊断高度不典型增生和早期癌的灵敏度和特异度能够达到96%和63%[6]。但是在家的高风险人群中进行食管内镜检查和组织学采样面临实际困难——医疗资源的匮乏。因此，探索一种简便、价格便宜、病人容易接受的筛查方法是必要的。

    虽然使用血清分子标记物用于筛查符合上述要求，但目前具有应用价值（较高的灵敏度和特异度）的指标还不多，也未报道过其在筛查癌前病变、鳞状上皮不典型增生的功用。所以本研究根据既往选择了部分可能的指标来探索它们在食管癌筛查方面的价值。MMP?9是一种胶原酶，它在肿瘤细胞转移中具有一定作用。食管鳞状上皮不典型增生人群组的MMP?9浓度显著低于正常和食管炎组。病理分级散点图显示，食管癌组MMP?9浓度值的分布更发散一些，而且与不典型增生相比其中位数更大。本研究数据结果不能说明为什么会出现上述现象，还需进一步研究。从ROC曲线可知MMP?9单独使用不能够用于筛查试验，但如果将MMP?9和其他分子指标进行组合应用会有一定的实际价值。有文献报道TIMP?1[7?9]、Cu/Zn过氧化物歧化酶[10，11]、抗?p53自身抗体[12?15]和IL?2sRα[16?18]与食管癌有一定相关关系，但本研究结果未显示有相关性。值得注意的是抗?p53自身抗体有较高阳性率，由于我们没有检测过该人群抗?p53自身抗体分布情况，也未研究过它与癌症风险状况的关系，因此抗?p53自身抗体与不典型增生出现的先后次序仍然是一未知领域。

    本研究的诊断标准——食管镜下Lugol 氏碘液染色+组织活检诊断不典型增生和食管癌，它具有很高的灵敏度，因此基本不存在漏诊问题；其次，本研究对象是从人群为基础的队列中获得的志愿者，所以研究结果有一定的可信性。为了做快速筛查只选用了其中84例样本，虽然在一定程度上减小了检测各病理级别间分子指标浓度分布差别的能力，但从分布图可初步得出，除了MMP?9外其他指标临床应用前景可能不高。

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