cyclinE、CDK2在子宫平滑肌肿瘤中的表达
【关键词】 cyclinE；CDK2；子宫平滑肌肿瘤
子宫平滑肌肿瘤（uterine smooth muscle tumors, USMTs）是妇女最常见的肿瘤。细胞周期素（cyclinE）是G1期的周期蛋白，与细胞周期素依赖性激酶2（CDK2）在G1期末结合而发挥作用，促进细胞进入S期。近年来，在多种肿瘤的研究中发现有cyclinE、CDK2表达的异常，但其在USMTs中的研究，国内尚未见报道。增殖细胞核抗原（PCNA）是反映细胞，特别是恶性肿瘤细胞增殖活性的一个指标。本研究拟通过免疫组织化学方法探讨cyclinE、CDK2及PCNA在USMTs中的表达及临床意义。
1 资料与方法
1.1 临床资料 选取华中科技大学同济医学院附属同济病理科1992年7月～2004年10月存档的因USMTs而手术切除子宫的蜡块标本75例，其中，良性子宫平滑肌瘤（usual leiomyoma, UL）35例，交界性子宫平滑肌瘤（borderline leiomyoma, BLM）22例，子宫平滑肌肉瘤（leiomyosarcoma, LMS）18例。 于手术室另取正常子宫平滑肌组织（Myometrium, M）20例，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋常规处理。
1.2 试剂 鼠抗人cyclinE单克隆抗体，工作浓度1∶100；鼠抗人CDK2单克隆抗体，工作浓度1∶50；鼠抗人PCNA单克隆抗体，工作浓度1∶50，均为美国Santa Cruz公司产品，购于北京中山生物工程公司。SP试剂盒与DAB显色试剂盒均为Zymed公司产品。
1.3 方法 采用免疫组织化学SP法分别检测UL组、BLM组、LMS组及M组的cyclinE、CDK2及PCNA蛋白表达。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照，微波炉抗原修复，DAB显色。
1.4 染色结果的判断 cyclinE、CDK2及PCNA均以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性染色。
1.5 图像分析 应用HMIAS?2000型全自动彩色图象分析系统对各组切片进行分析，每组随机选取30个视野（20×物镜），分别测定每个视野下阳性染色的面积，平均光度及积分光度。
1.6 统计分析 用SPSS10.0软件包行t检验及Spearman等级相关分析，检验水准a＝0.05。
2 结果
2.1 cyclinE、CDK2及PCNA在各组中的染色 cyclinE及CDK2在USMTs中的表达，大多定位在细胞核内，少数在胞浆。而PCNA在USMTs中的表达，几乎均在细胞核内，图略。
2.2 cyclinE、CDK2及PCNA在各组中的染色面积 cyclinE、CDK2及PCNA在UL组的表达（1531.6±373.9、1776.9±264.3、2576.9±247.4）均明显高于M组（643.9±174.2、538.1±134.7、946.2±205.9），P<0.05；其在BLM组的表达仅CDK2在BL组（1623.4±244.6）低于UL组（1776.9±264.3），其余均高于UL组，但差异无统计学意义，P＞0.05；而其在LMS组的表达（5511.7±520.4、5335.3±452.8、6174.6±498.5）均明显高于UL组及BLM组（2078.8±305.5、1868.5±266.7、3072.1±304.7），P<0.05。
2.3 cyclinE、CDK2及PCNA分别在各组USMTs中的染色平均光度 cyclinE、CDK2及PCNA三个指标在UL组的表达（0.138±0.015、0.129±0.020、0.163±0.018）均明显高于M组（0.053±0.002、0.069±0.006、0.077±0.005），P<0.05；其在BLM组的表达（0.157±0.016、0.138±0.022、0.181±0.023）均高于UL组，但差异无统计学意义，P＞0.05；而其在LMS组（0.259±0.031、0.238±0.026、0.288±0.033）的表达均明显高于UL组及BLM组， P<0.05。
2.4 cyclinE、CDK2及PCNA在USMTs中的相关性分析 cyclinE、CDK2及PCNA在正常子宫肌组织中的表达均无明显相关关系；在UL组及BLM组随着PCNA表达的增加，cyclinE、CDK2的表达也相应增加，但只有cyclinE的表达与PCNA之间呈正相关（r=0.563，P<0.05），其余均无统计学意义，P＞0.05；在LMS组cyclinE与CDK2，cyclinE与PCNA，CDK2与PCNA之间均呈正相关，相关系数分别为：r=0.517，P<0.05；r=0.623，P<0.05；r=0.461，P<0.05。
3 讨论
3.1 PCNA的表达与USMTs的关系 PCNA亦称细胞周期素，作为DNA聚合酶的辅助蛋白直接参与细胞增殖过程中的DNA复制［1］， 其表达情况可作为细胞增殖状态指标。本研究结果发现，PCNA的表达在UL组明显高于M组，LMS组明显高于UL组及BLM组，差异均具有显著性意义，P<0.05。这些结果表明，LMS的细胞增殖活性明显高于UL及BLM。本研究还发现PCNA在BLM组的表达高于UL组，但差异无统计学意义，P＞0.05，说明UL与BLM的细胞增殖活性没有明显区别，尽管它们的细胞型和细胞非典型性存在差别。本研究结果表明PCNA的过量表达的确与USMTs平滑肌细胞的过度增生和恶性转化有密切关系，增生越活跃，恶性程度越高，表达亦越高。
3.2 cyclinE、CDK2的表达与USMTs的关系 cyclinE是G1期重要的细胞周期调控因子之一，其异常表达能促进肿瘤的发生，可作为判断预后的辅助指标。cyclinE在G1期合成， G1/S交界处急剧升高达高峰，S期逐渐降低至消失［2］。CDK2存在于整个细胞周期中，是cyclinE的催化亚基，而cyclinE是CDK2的调节亚基，其与CDK2结合形成一活性复合物并使CDK2激活，可促使细胞由G1期进入S期。cyclinE过高表达使CDK2持续激活，细胞周期调节失控而异常增生。
本次研究结果证实了cyclinE、CDK2在USMTs的表达，与UL组相比，LMS组中cyclinE、CDK2的表达有显著升高，P<0.05，说明cyclinE、CDK2的高表达与平滑肌细胞的增殖活跃、肿瘤的恶性潜能有密切关系。事实上，cyclinE、CDK2的高表达很可能促进了LMS强大的增殖潜力。另外发现， cyclinE、CDK2在BLM组的表达也高于UL组，但无统计学意义，P＞0.05，表明细胞周期调控机制在BLM和UL中无明显差别，暗示BLM肿瘤可能已发展成一种细胞周期调控失常的状态，据此推测与这种肿瘤的诊断标准是相符的。
本研究还发现cyclinE和CDK2在LMS组中的表达与PCNA有明显的正相关性， 提示LMS具有高度的细胞增殖活性，进一步证实了在子宫平滑肌肿瘤的发生发展过程中存在有细胞周期G1期至S期细胞周期调控失常导致的细胞异常增生。Baek等［3］发现子宫肌瘤组织中cyclinE和CDK2的表达明显高于正常子宫肌组织，并把cyclinE作为有力的诊断工具，与本实验结果一致。Zhai等［4］也曾报道cyclinE和CDK2在子宫平滑肌肿瘤组织中有表达， 且其表达水平的高低与恶性程度有关。
综上所述，cyclinE、CDK2和PCNA在USMTs发病机制中的作用是肯定的。cyclinE和CDK2的异常表达已在多种恶性肿瘤中被报道，其中包括乳腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌等，其在临床上作为一种诊断及判断预后指标或联合指标， 可辅助临床工作者的诊治工作。 有报道［5］如果将cyclinE的抗体注入培养的哺乳动物细胞内则使细胞周期停滞在G1期。 所以进一步研究cyclinE抗体和CDK2抗体能否阻止培养的子宫平滑肌细胞的增殖及其恶性转化机制，应用相关方法防治USMTs的发生发展是有待解决的问题。
【文献】
［1］ 李莜梅， 郑英. 宫颈癌组织中cyclinE和细胞增殖核抗原检测［J］. 郑州大学学报，2004，39（3）：468?470.
［2］ Arooz T, Yam CH, Siu WY, et al. On the concentrations of cyclins and cyclin?dependent kinase in extracts of cultured human cells ［J］. Biochemistry, 2000, 39(31): 9494?9501.
［3］ Baek WK, Kim D, Jung N, et al. Increased expression of cyclin G1 in leiomyoma compared with normal myometrium［J］. Am J Obstet Gynecol, 2003, 188(3): 634?639.
［4］ Zhai YL, Nikaido T, Shiozawa T, et al. Expression of cyclins and cyclin?dependent kinase in smooth muscle tumors of the uterus ［J］. Int J Cancer, 1999, 84(3): 244?250.
［5］ 黄玫， 廖松林. 周期素E在细胞周期调节中的作用［J］. 国外医学遗传学分册， 2000， 23(1)：40?42.
