口腔鳞癌中IL?8的表达及其与微血管生成的关系
作者:周健,徐文华,陈乔尔,王元银,王银龙,何家才
【摘要】 目的 探讨白细胞介素?8(IL?8)的表达与口腔鳞癌(OSCC)血管形成和生物学行为的关系及意义。方法 应用免疫组织化学技术检测55例OSCC手术切除标本和10例正常口腔粘膜标本中IL?8的表达及肿瘤内的微血管密度(iMVD)。结果 口腔鳞癌标本中32例(58.18%)IL?8呈阳性表达,口腔鳞癌微血管密度为38.58±12.43;IL?8评分为高级的口腔鳞癌组织iMVD高于IL?8评分为阴性和低级的口腔鳞癌组织。iMVD与IL?8呈正相关(rs=0.699,P<0.01)。结论 IL?8表达与肿瘤内iMVD明显相关,同时与口腔鳞癌的病理分级、临床分期及淋巴结转移关系密切。IL?8很可能以促血管生成因子的角色在口腔鳞癌的发生、中起重要作用。
【关键词】 白细胞介素?8;新生血管化;微血管密度;免疫组织化学
Relation of Interleukin?8 Expression with Angiogenesis in Human Oral Souamous Cell Carcinoma
Key words:Interleukin?8;Angiogenesis;Microvessel density;Immunohistochemistry
近几年来,白细胞介素8(interleukin?8,IL?8)作为一种新发现的影响肿瘤微血管生成的有效指标已被用于多种人类肿瘤的研究[1,2],但其在口腔鳞癌中的表达及临床病意义的研究较少。我们利用免疫组织化学方法观察口腔鳞癌癌组织中IL?8的表达及其与微血管生成的关系。
1 资料和方法
1.1 资料
55例口腔鳞癌标本取自2000年2月~2005年2月间安徽医科大学第一附属和附属口腔医院住院患者。男35例,女20例。年龄29~68岁,平均47.51±8.10岁。其中颊12例,舌25例,口底6例,牙龈7例,上腭3例,磨牙后区2例。所有标本均为手术切除标本,术前未经放、化疗,术后均经病理证实。
按国际抗癌联盟(UICC)1992年临床分期标准:Ⅰ期12例,Ⅱ期21例,Ⅲ期17例,Ⅳ期5例。按OSCC病理分级:高分化25例,中分化17例,低分化13例。10例正常口腔粘膜标本取自我院门诊口腔良性疾病患者,经病理学检查证实。
1.2 试剂来源
IL?8 抗体为兔抗人单克隆抗体,购于武汉市博士德生物技术公司。CD34鼠抗人单克隆抗体、链霉卵白素?过氧化酶(SP)试剂盒和DAB试剂盒均购于福州迈新生物技术开发公司。
1.3 IL?8表达的测定
采用链霉菌抗生物素蛋白?过氧化酶连接(SP)免疫组织化学方法。以IL?8单抗作为第一抗体,操作参照试剂说明书进行。于免疫染色最多的区域计数1 000个鳞癌细胞,阳性细胞百分数和染色强度。染色强度:0为阴性,1为弱阳性,2为阳性,3为强阳性;阳性细胞百分数:0为0,1为<25%,2为25%~50%,3为>50%;染色强度与阳性细胞百分数和>2即为免疫组化阳性。IL?8评分分级:0~2为阴性,3~4为低级,5~6为高级。
1.4 微血管密度(iMVD)的测定
应用抗CD34单抗步骤同上。计数方法参照Yuan等的评判标准[3]:与毗邻微血管、肿瘤细胞、其他结缔组织不相连的任何褐色组化染色的内皮细胞均作为一条独立的微血管,有平滑肌包绕的大血管除外。每一标本在低倍镜(×100)下选3个微血管数最多的区域即“热点”,在每一个区域中计数一个高倍镜(×400)下的微血管数,取3个视野的均值。
1.5 实验对照
以试剂盒中随赠的阳性切片作阳性对照,用PBS代替一抗作阴性对照
1.6 统计学方法
采用SPSS11.0统计软件包作统计分析。计数资料采用χ2检验,计量资料两组间比较选择两样本t检验,多组间比较选择方差分析,相关分析采用spearman等级相关分析。
2 结果
2.1 IL?8表达及其与各临床病理指标间的关系
55例口腔鳞癌标本中IL?8染色阳性为32例(58.18%),正常组织中其表达为阴性。IL?8主要表达于鳞癌细胞胞浆和胞核,呈棕褐色。偶见于浸润的炎症细胞,而基质细胞呈阴性染色,见图1。经χ2检验,IL?8表达与口腔鳞癌患者年龄、性别、肿瘤大小无关,而与病理分级、临床分期及淋巴结转移关系密切,见表1。
2.2 口腔鳞癌中iMVD及其与各临床病理指标间的关系
所有口腔鳞癌以CD34标记的iMVD为38.58±12.43,正常组织的iMVD为10.37±4.65。CD34表达主要位于血管内皮细胞,呈棕褐色,见图2。癌区组织中微血管形态不规则,分布不均, 微血管最多的区域位于癌巢的周边部呈簇状,部分呈发芽状。正常口腔粘膜组织中分布较少而均匀。经统计分析,口腔鳞癌的iMVD较正常组织有显著性增高(P<0.05)。口腔鳞癌的iMVD与口腔鳞癌患者年龄、性别、肿瘤大小无关,而与病理分级、临床分期及淋巴结转移关系密切,见表2。表1 口腔鳞癌中IL?8表达与各临床病理指标之间的关系注:χ2检验,*为三组间比较,P<0.05;**为高分化与低分化间比较,P<0.05表2 口腔鳞癌中iMVD与各临床病理指标之间的关系
2.3 IL?8表达与iMVD的相互关系
IL?8为高级(评分5~6分)时,鳞癌组织iMVD(49.56±10.09)明显高于IL?8为阴性(评分0~2分)的鳞癌组织(30.42±9.84)和IL?8为低级(评分3~4分)的鳞癌组织(39.31±9.00),P<0.01。IL?8评分与iMVD作spearman 等级相关分析,rs=0.699,P<0.01,两者之间呈正相关。
3 讨论
肿瘤的血管形成对所有实体瘤的发病机制是至关重要的。在局部缺乏毛细血管增殖的条件下,肿瘤的生长不会超出2~3mm。新生成的血管把还在生长的肿瘤和循环系统直接连接起来,使其供肿瘤生长的物质得以交换。此外,肿瘤还利用新生血管作为转移的方式,通过血液循环将原发癌细胞输送至转移靶器官。因此,血管新生是决定肿瘤大小、局部和远处转移的关键因素。
对IL?8的深入研究已阐明,它是一种多功能的细胞因子。不仅能激活和趋化中性粒细胞、T淋巴细胞和嗜碱性粒细胞,还可以作为自分泌生长因子刺激肿瘤细胞增殖[4],亦能趋化内皮细胞并促进血管新生[5,6]。本组中iMVD表达与IL?8呈正相关,提示IL?8参与了人口腔鳞癌内新生血管的形成。其机制目前还不明确,但有研究发现在口腔鳞癌中IL?8和纤维蛋白的表达均较正常口腔粘膜显著增加,同时IL?8的表达和纤维蛋白的表达呈时间和剂量依赖性[7]。据此,我们推测IL?8在口腔鳞癌中通过增加血管通透性,使血管内液体、血浆蛋白、纤维蛋白原外渗,并使细胞外基质改变,纤维素沉积,进而形成新的血管和基质。而Riedel 等[8]则认为IL?8可通过基质金属蛋白酶降解基底膜糖蛋白和细胞外基质成分,造成内皮的侵入,调控血管新生。以上各机制的具体调控环节及相互关系如何,以及是否还有新机制等问题的解答还有待于今后深入研究。
我们的实验还发现,58.18%的鳞癌细胞IL?8染色阳性,而正常组织和基质细胞中IL?8染色阴性,提示口腔鳞癌细胞能分泌IL?8可能是IL?8高表达的主要原因。而Ⅲ、Ⅳ期和淋巴结有转移鳞癌标本中的IL?8表达和iMVD分别较Ⅰ、Ⅱ期和淋巴结无转移标本中明显增高,则提示IL?8的表达及微血管的形成可以促进肿瘤恶性演变,与口腔鳞癌的侵袭转移密切相关,检测IL?8和微血管有助于判断口腔鳞癌的进程及侵袭转移趋势。我们推测,随着晚期口腔鳞癌体积增长加快,肿瘤细胞迅速生成时对氧气的需要增加,必然导致缺氧,而缺氧可以诱导肿瘤细胞旁分泌IL?8,进而促进血管新生,而新生血管又为肿瘤的生长和转移创造了条件。Kunz的研究证实缺氧有助于IL?8 的表达,支持以上的观点[9] 。
目前,从抗微血管生成来肿瘤已经成为基础和临床研究的热点。开发特异性高、副作用小、可有效用于临床的IL?8抑制剂以及血管生成抑制剂与传统抗肿瘤药物的联用应当是今后的主要研究方向[10]。
【】
[1] Huang S, Mills L, Mian B, et al. Fully humanized neutralizing antibodies to interleukin?8 (ABX?IL8) inhibit angiogenesis,tumor growth and metastasis of human melanoma[J].Am J Pathol, 2002, 161(1): 125?134.
[2] Rogala E, Skopinska?Rozewska E, Sommer E, et al. Assessment of the VEGF, bFGF, aFGF and IL8 angiogenic activity in urinary bladder carcinoma,using the mice cutaneous angiogenesis test[J]. Anticancer Res, 2001, 21(6B): 4259?4263.
[3] Yuan A, Yang PC, Yu CJ, et al. Interleukin?8 messenger ribonucleic acid expression correlates with tumor progression, tumor angiogenesis, patient survival, and timing of relapse in non?small?cell lung cancer[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2000, 162(5): 1957 ? 1963.
[4] Seo SM, McIntire LV, Smith CW, et al. Effects of IL?8, Gro?alpha and LTB(4) on the adhesive kinetics of LFA?1 and Mac?1 on human neutrophils[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2001, 281(5): C1568?1578.
[5] Konno H, Ohta M, Baba M, et al. The role of circulating IL?8 and VEGF protein in the progression of gastric cancer[J].Cancer Sci, 2003, 94(8):735?740.
[6] Arenberg DA, Kunkel SL, Polverini PJ, et al.Inhibition of interleukin?8 reduces tumorigenesis of human non?small cell lung cancer in SCID mice[J]. J Clin Invest, 1996, 97(12): 2792?2802.
[7] Lalla RV, Spiro JD, Tanzer ML, et al. Association of fibrin and interleukin 8 in human oral squamous cell carcinoma[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 2003, 95(4): 452?457.
[8] Riedel F, Gotte K, Schwalb J, et al. Expression of 92?kDa type IV collagenase correlates with angiogenic markers and poor survival in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Int J Oncol, 2000, 17(6): 1099?1105.
[9] Kunz M, Hartmann A, Flory E, et al. Anoxia?induced up?regulation of interleukin?8 in human malignant melanoma.A potential mechanism for high tumor aggressiveness[J].Am J Pathol,1999, 155(3): 753?763.
[10]Tamatani T, Azuma M, Ashida Y, et al. Enhanced radiosensitization and chemosensitization in NF?kappaB?suppressed human oral cancer cells via the inhibition of gamma?irradiation? and 5?FU?induced production of IL?6 and IL?8[J]. Int J Cancer, 2004, 108(6): 912?921.