p27mt基因对大肠癌Lovo细胞粘附作用的影响

【摘要】  目的 研究人突变p27基因(p27mt)对大肠癌Lovo细胞粘附作用的影响，探讨p27mt基因在大肠癌Lovo细胞转移中的作用机制。方法 用Ad?p27mt转染大肠癌Lovo细胞， 采用Western blot 检测p27mt在Lovo中的表达。分别采用细胞计数法，MTT法检测p27mt基因对大肠癌Lovo细胞同质粘附、异质粘附作用的影响。结果 Ad?p27mt转染Lovo细胞后，同质粘附作用高于Ad?LacZ组和对照组，异质粘附作用低于Ad?LacZ组和对照组。结论 上调p27mt基因的表达，可使大肠癌细胞间的同质粘附作用增强，异质粘附作用降低，因此，p27mt基因具有抑制大肠癌细胞转移的功能，其机制是改变了细胞基质及细胞间的粘附能力。

【关键词】  p27mt基因；大肠癌Lovo细胞；同质粘附；异质粘附

基金项目：十堰市科技局资助项目（2005ZD036）

    The Adhesion Effect of Colorectal Carcinoma Lovo cells by Human Mutant p27mt Gene 

    SONG Shi?mao1,CHEN Jun2

    1.Department of Oncology,Affiliated Taihe's Hospital,Affiliated People's Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan  442000,China;2.Department of Gastroenterology

    Corresponding author:CHEN Jun,E?mail:sycj@sycatv.netAbstract：Objective   To study the effect of p27mt transfected into human colorectal carcinoma Lovo cells,and to explore the mechanism of p27mt gene on the metastases of colorectal carcinoma Lovo cells.Methods  The expression of p27mt on the p27mt?transfected Lovo cells was determined p27mt protein expression with Western Blot. The effect of p27mt gene on the homogeneity adhesion of human colorectal carcinoma was measured with cell count,and the heterogeneity adhesion was determined by MTT method.Results  High expression of p27 on the p27mt?transfected Lovo cell was observed.The homogeneity adhesion of p27mt?transfected Lovo cell group was higher than Ad?lacZ group and contrast group,and the heterogeneity adhesion was lower than Ad?lacZ group and contrast group.Conclusion  The p27mt gene can promote homogeneity adhesion and reduce heterogeneity adhesion of colorectal carcinoma Lovo cells.p27mt gene might function as inhibitor of colorectal carcinoma metastasis.

    Key words：p27mt gene;Colorectal neoplasm Lovo cells;Homogeneity adhesion；Heterogeneity adhesion

    p27是一种多功能细胞周期素依赖激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitor,CDKI),其主要功能是通过阻止细胞G0/G1期至S期的转换，实现对细胞周期的负性调控，对肿瘤细胞有明显的生长抑制和促凋亡作用[1]。本研究旨在探讨人突变p27（p27mt）基因在大肠癌细胞转移过程中对肿瘤细胞粘附作用的影响。

    1材料与方法

    1.1材料

    人大肠癌细胞株Lovo细胞购自武汉大学典型物保藏中心，人突变p27重组腺病毒（Ad?p27mt）由陈珺构建[2]，LacZ重组腺病毒（Ad?LacZ）由郧阳医学院临床医学研究所王家宁博士构建[3]，纤维粘连蛋白（FN）购于武汉大学医学院病理教研室，RPMI 1640培养基，四氮唑蓝盐（MTT）为Sigma公司产品，小牛血清购自杭州四季青生物公司。Western blot检测试剂盒为美国KPL公司产品。

    1.2方法

    1.2.1细胞培养

    Lovo细胞培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，置37℃，5% CO2湿化培养箱内培养，在倒置显微镜下观察生长情况，Lovo细胞3天传代1次。取对数生长期细胞，经5g/L胰蛋白酶消化，用PBS液或无血清RPMI 1640培养液制成细胞悬液。采用血细胞计数板计数，台盼蓝拒染法测定细胞活力，只有细胞活力大于95%以上方可用于实验。

    1.2.2腺病毒转染效率测定

    待Lovo细胞达到60%～80%融合，用Ad?LacZ转染，感染复数（multiplicity of infection,MOI）分别为20、30、40、50，继续培养48h，经5g/L戊二醛固定15min，PBS洗2次后加入X?gal染液，37℃，50ml/L CO2培养箱内孵化4～24h计数蓝染细胞数。

    1.2.3Western blot检测 p27mt蛋白的表达

    取75cm培养瓶中用于实验的Lovo细胞，分别用Ad?p27mt（MOI= 50）和Ad?LacZ（MOI=50）转染，同时设不加病毒的Lovo细胞对照。分别将细胞用2.5g/L胰蛋白酶消化，收集细胞，用PBS洗2次。经1×SDS?PAGE 细胞裂解液500μl裂解后， 煮沸5min，离心取上清，提取蛋白质,分别取0.5ml行Western blot检测。

    1.2.4同质性粘附实验[4]

    采用机械法测定细胞粘附性，具体操作如下：96孔板中加入Lovo细胞（105个/ml），每孔100μl，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。当Lovo细胞铺至70%～80%时，实验组加入Ad?p27mt(MOI=50),Ad?LacZ组加入Ad?LacZ(MOI=50)而对照组加入未转染的Lovo 细胞，均在37℃，5% CO2培养箱中培养6h然后用无钙镁的PBS洗涤2次，0.25%胰蛋白酶消化制备细胞悬液，调整细胞浓度为105个/ml。以100μl/孔的量加入96孔已铺满Lovo细胞的培养板中，设6个复孔，置37℃，5%CO2培养箱中分别孵育60min、90min、120min后,吸出未结合的细胞悬液。在光镜下计数，以加入和吸出肿瘤细胞之差，肿瘤细胞粘附值，取其均值。

    1.2.5异质性黏附实验

    采用报告的方法[5]。将浓度为50μg/ml的FN 75μl加入96孔培养板中，用37℃预热的PBS液冲洗2次，加入10g/L PBS缓冲液稀释的小牛血清白蛋白（100μl/孔），封闭非特异性位点，再用PBS 200μl冲洗2次。在已经铺好FN的96孔板中加入Lovo细胞,浓度为105个/ml，实验组加入Ad?p27mt(MOI=50),Ad?LacZ组加入Ad?LacZ(MOI=50)而对照组加入未转染的Lovo细胞,分别培养60min、90min、120min。培养结束后，在倒置显微镜下观察，之后缓慢吸出培养液，用PBS冲洗未粘附的细胞，冲洗2次，加入含10g/L FCS RPMI1640培养液200μl，每孔加入5mg/ml的四氮唑兰盐（MTT）20μl，继续培养4h。吸出液体，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μl，室温孵育10min。用Biol Rad酶联免疫检测仪在570nm处测光密度值（A570）。每组设6个复孔，取其均值。

    1.3统计学处理

    数据结果用±s表示，用students’t检验进行统计学分析。

    2结果

    2.1重组腺病毒对Lovo细胞转导率的影响

    X?gal染色， 用Ad?LacZ转染Lovo细胞后，对腺病毒的转导率进行评估，结果显示MOI≥50时，Lovo细胞就可达100%转导率，表明重组腺病毒能有效地介导目的基因在Lovo细胞中表达。

    2.2p27mt蛋白表达的检测结果

    将Lovo细胞用Ad?p27mt（MOI=50）转染24h后收集细胞，用1×SDS×PAGE裂解液裂解细胞后，在100℃条件下煮沸5min，离心取上清，用KPL公司的Western blot检测试剂盒对p27蛋白进行检测，经TMB染色后，Ad?p27mt转染的细胞呈蛋白高表达，而Ad?LacZ转染的细胞和不加病毒对照组仅有微量（内源性）27KD的蛋白质表达，说明本实验所构建的人突变p27重组腺病毒在Lovo中可正确表达p27mt基因，并在细胞内实现了蛋白产物的高表达，见图1。

    图1Western blot 检测p27蛋白的表达

    2.3p27mt对Lovo细胞粘附的影响

    Ad?27mt作用于Lovo细胞120min后，即有同质粘附作用增强,与Ad?LacZ组和对照组比较有显著统计学意义（P<0.01），而Ad?LacZ组和对照组比较没有显著统计学意义(P>0.05)，见表1。表1p27mt对Lovo细胞同质粘附的影响**与Ad?LacZ组和对照组比较有显著性意义(P<0.01);* Ad?LacZ组和对照组比较没有显著性意义(P>0.05)2.4p27mt对Lovo细胞异质粘附的影响

    p27mt可以使Lovo细胞与基质的粘附作用（异质性粘附作用）降低，明显低于Ad?LacZ组和对照组（P<0.01）。Ad?LacZ组和对照组细胞作用120min后，细胞与FN全部发生了粘附，且FN表面有降解现象，而Ad?p27mt组细胞只有少部分发生了粘附，FN表面没有降解现象，见表2。表2p27mt诱导Lovo细胞异质粘附的影响

　　3讨论

    肿瘤转移是多因素、多基因综合作用的结果，其中与癌细胞的运动、粘附、瘤体内血管形成，癌细胞凋亡等有密切关系。癌基因与抑癌基因的发现有助于探讨促进或抑制肿瘤生长、转移的有关问题。近年来的研究提示，p27基因的表达对大肠癌的转移、患者预后、都具有十分重要的意义[6?9]。Zhang等[9]研究发现，p27基因的表达与性别、年龄、肿瘤的位置，生长方式、以及p53、p73、DCC的表达无关，而与患者的预后明显相关。Yao等[10]研究发现p27基因的表达下调可以降低肿瘤细胞之间的粘附。Nakamura等[11]证实p27蛋白的低表达与大肠癌的侵袭行为密切相关。这些均提示p27基因的表达与大肠癌的转移有密切关系。

    p27蛋白的降解，主要是由泛素介导p27的187位苏氨酸磷酸化引起的。Jean等[12]将p27基因187位苏氨酸置换成丙氨酸（T187A）转染HeyC2细胞，发现细胞生长明显抑制。并且证明突变p27（T187A）基因比野生型p27基因的抑制作用更强。Park 等[13]将p27mt[p27(thr?187/pro?188 to met?187/Ile?188)]构建复制缺陷重组腺病毒，用于转染肺癌细胞株，发现p27mt比野生型p27(wild type p27,p27wt) 有更强的抑制增殖作用。本研究用Ad?p27mt转染大肠癌Lovo细胞后，通过Western blot检测证实了p27mt在Lovo细胞中获得了蛋白高表达。Ad?p27mt转染的Lovo细胞同质粘附能力强于Ad?LacZ组和对照组，而异质粘附能力明显下降，且在作用于60min时就开始出现,并在作用于120min时同质粘附作用显著增强,而异质粘附作用显著下降。从而证实了p27mt基因具有抑制大肠癌细胞转移的功能，且随着p27蛋白表达的增加,作用时间的延长,抑制转移能力亦增强,其机制是改变了细胞与基质及细胞间的粘附能力。前期研究[14]发现p27mt基因抑制肿瘤细胞的生长及促进细胞的凋亡，也是抗肿瘤转移的机制之一。

【】
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