利用siRNA抑制HER?2表达的研究
【关键词】 siRNA
The Inhibition of HER?2 Expression by siRNA
Abstract：Objective To inhibit the expression of HER?2 gene in MCF?7 human breast carcinoma cells by siRNA. Methods Five siRNAs targeting HER?2 were designed, and their corresponding expression vectors were constructed and transformed into MCF?7 cells. After selection, the stable transfected cells were obtained. The HER?2 mRNA abundance in the stable transfected cells was analyzed by RT?PCR. The HER?2 protein expression in these cells was analyzed by flow cytometry (FCM). The stable transfected cells were transplanted in nude mice, and the HER?2 protein expression in transplant tumor was detected with immunohistochemical method. Results siRNA 3P could effectively decrease the HER?2 mRNA expression in MCF?7 cells. The FCM data showed that the HER?2 protein expression in siRNA 2P and 3P transfected MCF?7 cells decreased. All the five siRNAs targeting HER?2 could decrease the tumorigenesis of MCF?7 cells in nude mice. Correspondingly, the HER?2 protein expression in transplant tumors was also reduced. Conclusion The siRNAs targeting HER?2 mRNA could effectively inhibit HER?2 expression in vivo and in vitro, and will be useful for gene therapy of breast cancer.
Key words：HER?2; Small interfering RNA (siRNA); Breast cancer
摘要：目的 利用siRNA抑制人乳腺癌MCF?7细胞中HER?2基因的表达。方法 针对HER?2 mRNA设计了5条siRNA，并构建相应的表达质粒，将质粒转染MCF?7乳腺癌细胞，筛选稳定表达株，利用RT?PCR分析siRNA对细胞中HER?2 mRNA的降解作用；利用流式细胞术分析细胞表面HER?2蛋白的表达；利用裸鼠进行体内成瘤性实验，用免疫组化法检测瘤组织中HER?2的表达。结果 siRNA 3P能明显降低MCF?7细胞中HER?2 mRNA的丰度；流式细胞分析表明，其中siRNA 2P 和3P稳定转染的MCF?7细胞表面HER?2的表达明显降低；五种表达不同siRNA的MCF?7细胞在裸鼠体内的成瘤性均有所降低，并且瘤组织中HER?2蛋白的表达也明显减少。结论 靶向HER?2 mRNA 的siRNA能在体内外有效抑制HER?2的表达，可用于乳腺癌的基因。
关键词：HER?2；小干涉RNA（siRNA）；乳腺癌
0 引言
HER?2在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肺癌等多种恶性肿瘤中存在基因扩增或过度表达，而在正常人体腔上皮、腺上皮及胚胎中表达水平很低[1]。约30%的乳腺癌患者伴随HER?2的过表达[2]，HER?2过表达与乳腺癌的发生、、转移和不良预后密切相关。
RNA干涉（RNA interference, RNAi）是近年发展起来的一种快速、高效、易于操作的使特异靶基因失活的技术。本实验利用RNAi技术，以HER?2基因为靶点，设计了5条小干涉RNA（small interfering RNA, siRNA），并从细胞及实验动物水平，观察了siRNA对HER?2表达的特异性抑制作用，探讨siRNA作为肿瘤基因治疗的可行性和特异性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 人乳腺腺癌MCF?7细胞株由本室保存，在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基、37℃、5%CO2孵箱中培养。
1.1.2 质粒 pSilencerTM 2.1?U6 hygro siRNA表达载体购自Ambion公司。
1.1.3 试剂 胎牛血清、RPMI1640培养基为GIBCOBRL产品；限制性内切酶BamHⅠ，HindⅢ，T4连接酶，Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒，逆转录酶M?MLV购自Promega公司；Trizol试剂，转染试剂Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品；Hygromycin B购自Roche公司；HER?2小鼠抗人单克隆抗体购自Sigma公司；FITC标记的羊抗小鼠IgG抗体购自中山公司。
1.1.4 实验动物 4～6周龄雌性BALB/c裸鼠购自医学院动物研究所。
1.2 方法
1.2.1 发夹siRNA转录模板的设计 发夹siRNA转录模板的结构如图1所示。siRNA的靶序列长度为19nt，两个反向互补排列的19nt特异性序列由一个9nt的Loop相连接，形成茎环结构。转录模板两端分别为BamHⅠ、HindⅢ酶切位点，并以6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。人HER?2的mRNA基因序列从GenBank获得，序列号为NM_004448，利用程序siRNA DNA Designer 1.3设计针对HER?2的siRNA，从中选择5段19nt的特异性靶序列，分别合成5条发夹siRNA转录模板，见表1。
1.2.2 质粒构建 将合成的5条siRNA转录模板序列退火后，连入线性化载体pSilencerTM 2.1?U6 hygro上，先经筛选、酶切鉴定后，再进行测序确定，构建的质粒分别命名为pSilencer?1P?HER?2，pSilencer?2P?HER?2，pSilencer?3P?HER?2，pSilencer?5P?HER?2，pSilencer?6P?HER?2，简称p?1P，p?2P，p?3P，p?5P，p?6P。对照质粒pSilencer 2.1?U6 hygro Negative Control由Ambion公司提供，简称p?N。
1.2.3 细胞培养及转染 转染前一天，将对数生长期的MCF?7细胞以2×105每孔接种于6孔板中培养，24h后，按照转染试剂Lipofectamine 2000的使用说明书将质粒?脂质体复合物（质粒∶脂质体=1∶2）转染细胞，37℃、5%CO2条件下在无血清、无抗生素的培养液中转染5h后换含10%胎牛血清的新鲜培养基，继续培养2天。然后用含有200μg/ml Hygromycin B的选择培养基初步筛选细胞，逐渐增加Hygromycin B的浓度至800μg/ml筛选培养14天，最终获得的单克隆细胞即为稳定转染细胞系。质粒p?N转染作为阴性对照，质粒p?1P、p?2P、p?3P、p?5P、p?6P分别转染得到稳定表达siRNA的细胞株。
1.2.4 pSilencer?HER?2转染MCF?7细胞后HER?2表达的检测 采用RT?PCR法分析细胞中HER?2的mRNA含量：收集稳定转染的细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA，取2μgRNA用M?MLV逆转录酶合成cDNA。以cDNA为模板PCR扩增HER?2片段，50μl反应体系：cDNA模板0.3μg，0.25mM dNTPs，上下游引物各1μM，Taq DNA聚合酶2u，5μl 10×buffer。30个热循环的参数：94℃ 60s，60℃ 60s，72℃ 90s。同时以GAPDH作对照。HER?2扩增引物为：正义，5’?CGGGAGATCCCTGACCTGCTGGAA?3’；反义，5’?CTGCTGGGGTACCAGATACTCCTC?3’，扩增产物为300bp。GAPDH扩增引物为：正义，5’?CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA?3’；反义，5’?TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC?3’，扩增产物598bp[3]。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，通过自动凝胶成像分析系统，将电泳结果进行扫描分析。
采用间接免疫荧光检测HER?2蛋白表达的变化：离心收集转染细胞，PBS洗一次后，鼠血清（1∶200稀释）封闭30min，PBS洗一次，以PBS稀释HER?2单抗（1∶20），室温孵育30min，细胞经PBS洗一次后，加入FITC标记的羊抗小鼠IgG（1∶50稀释），室温避光孵育30min，PBS洗一次，流式细胞仪检测，488nm激发波长下检测细胞表面HER?2的表达。
图1 发夹siRNA的转录模板结构 （略）
表1 合成的发夹siRNA转录模板序列（略）
1.2.5 裸鼠皮下移植瘤实验 取稳定转染的细胞2×106个，接种于BALB/c裸鼠背部皮下。在接种后第21天拉颈处死裸鼠，分离出瘤组织，测量瘤的长度(a)、宽度(b)和高度(c)，求出肿瘤近似体积(V)，V=π/6×abc[4]，单位mm3。采用免疫组织化学方法检测肿瘤中HER?2蛋白的表达变化。
1.2.6 统计学处理 实验结果采用方差分析和t检验进行统计学分析。
2 结果
2.1 稳定转染siRNA表达质粒对MCF?7细胞HER?2表达的影响
采用半定量RT?PCR法检测转染和未转染MCF?7细胞中HER?2 mRNA的量。 mRNA的相对量以PCR产物的琼脂糖电泳条带的亮度来判断。实验结果显示，p?1P、p?2P、p?3P、p?5P、p?6P稳定转染的MCF?7细胞中HER?2的mRNA表达明显降低，其中p?3P稳定转染细胞中HER?2 mRNA量最低，干涉效果最明显。转染对照质粒（p?N）的MCF?7细胞中mRNA的量与未转染的MCF?7细胞中mRNA的量一致，见图2。
图2 siRNAs抑制MCF?7细胞中HER?2的表达（略）
1: MCF?7细胞; 2: 转染p?N的MCF?7细胞; 3: 转染p?1P的MCF?7细胞; 4: 转染p?2P的MCF?7细胞; 5: 转染p?3P的MCF?7细胞; 6: 转染p?5P的MCF?7细胞; 7: 转染p?6P的MCF?7细胞; M: DNA markers
采用间接免疫荧光法检测稳定转染的MCF?7细胞中HER?2蛋白的表达。如果siRNA对HER?2的干涉作用强，则细胞表面表达的HER?2蛋白也就少，那么细胞表面的荧光强度降低，检测到的峰就会左移。流式检测结果表明，转染p?3P、p?2P的MCF?7细胞检测峰明显左移，HER?2表达明显低于对照组，其余组的峰形偏移不明显，见图3。
图3 流式细胞术分析稳定表达siRNA的MCF?7细胞表面HER?2蛋白的表达（略）
N: 转染p?N的MCF?7细胞; 1P: 转染p?1P的MCF?7细胞; 2P: 转染p?2P的MCF?7细胞; 3P: 转染p?3P的MCF?7细胞; 5P: 转染p?5P的MCF?7细胞; 6P: 转染p?6P的MCF?7细胞
2.2 裸鼠皮下移植瘤实验结果
pSilencer?HER?2转染组裸鼠皮下移植瘤与p?N转染组裸鼠皮下移植瘤比较，瘤体积均减小，其中p?1P、p?3P组减小最明显，与p?N对照组相比，瘤体积分别减小了53.5%和41.0%，见图4。肿瘤组织中HER?2蛋白的免疫组织化学检测结果见图5，图中细胞核被染成蓝紫色，HER?2蛋白阳性信号为棕黄色颗粒，从棕黄色的多少与深浅可以看出HER?2蛋白表达的多少，如图中箭头所示，p?3P组的移植瘤中HER?2蛋白量很少，干涉效果明显。应用CMIAS系统多功能真彩色病理图像分析系统，以积分光密度（integral optical density, IOD）值反映免疫组化阳性信号的强度，IOD值越大，HER?2阳性越强；IOD值越小，HER?2阳性则越弱。对其进行统计分析，比较结果见表2。p?1P、p?2P、p?3P和p?6P组与p?N对照组比较，差异均有显著性意义（P<0.01）。
表2 免疫组化图像分析裸鼠移植瘤中HER?2蛋白的表达（略）
*与p?N对照组比较P<0.01
图4 转染组裸鼠皮下移植瘤体积比较图（略）
1: p?N组; 2: p?1P组; 3: p?2P组; 4: p?3P组; 5: p?5P组; 6: p?6P组.
3 讨论
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，术后复发和转移率较高，全世界每年约有50万妇女死于乳腺癌。研究发现，HER?2在乳腺癌的发生、、和预后中发挥重要作用，由此产生以HER?2为靶点的治疗理念。人源化单克隆抗体trastuzumab（商品名Herceptin）是第一个针对HER?2阳性的转移性乳腺癌的治疗药物，也是第一个生物靶向治疗乳腺癌的药物，单药及联合用药已经成功用于临床[5?7]。虽然Herceptin在临床应用中存在心脏毒性的问题[8]，但Herceptin仍然是靶向治疗乳腺癌最成功的抗体药物。这说明HER?2是目前乳腺癌治疗最理想的药物靶点。
siRNA是近年来发展起来的特异性基因沉默技术[9]，已成为分子生物学研究的重要技术手段之一，在人类基因功能研究及疾病基因治疗方面已显现出巨大的应用前景。目前，利用RNAi对白血病[10]、乙型肝炎[11]、丙型肝炎[12]、艾滋病[13]的治疗研究已取得一定进展。本研究希望利用RNAi技术抑制HER?2的表达，以实现对HER?2过表达乳腺癌的治疗。
在设计靶基因HER?2的siRNA转录模板时，选择了HER?2基因外显子的不同区域，GC含量为42%～48%，均为19bp。并在HER?2的mRNA和蛋白水平，分别检测了5条siRNA的抑制效果。体外细胞试验结果显示，p?3P转染组中HER?2的mRNA和蛋白表达均显著降低，其余组的抑制效果不很明显。这说明针对靶基因不同位点所设计的siRNA诱导RNAi的效果是不同的。
裸鼠皮下成瘤实验中，与对照组相比较，siRNA稳定表达组肿瘤体积均有所减小，HER?2蛋白的表达也明显下调，这说明siRNA的表达降低了肿瘤细胞HER?2蛋白质的表达，从而使肿瘤细胞成瘤性降低。从肿瘤组织免疫组织化学图像分析结果看，稳定表达p?3P的肿瘤组织中HER?2蛋白的表达几乎被完全抑制，但其肿瘤却不是最小，而p?1P组肿瘤组织中HER?2蛋白的表达比p?3P组高，但该组的肿瘤却最小。这其中的机制尚不清楚。
本研究利用RNAi技术，针对HER?2基因，构建了表达多种siRNA的表达质粒，转染MCF?7乳腺癌细胞后得到了5种稳定表达细胞株，将这些细胞接种裸鼠后发现，其成瘤性比对照组降低，并且在肿瘤组织中HER?2基因的表达也明显降低。这说明RNAi有可能成为乳腺癌基因治疗的一种新选择。
（本文图5见第298页）（略）
【】
［1］ Lohrisch C, Piccart M. An overview of HER?2[J]. Semin Oncol, 2001, 28(6 Suppl 18): 3?11.
[2] Ménard S, Pupa SM, Campiglio M, et al. Biologic and therapeutic role of HER2 in cancer[J].Oncogene, 2003, 22(42): 6570?6578.
[3] Kr?hn G, Leiter U, Kaskel P, et al. Coexpression patterns of EGFR, HER2, HER3 and HER4 in non?melanoma skin cancer[J]. Eur J Cancer, 2001, 37(2): 251?259.
[4] 司徒镇强，吴军正.细胞培养［M］.西安：世界图书出版公司，1996.144?147.
[5] Vogel C, Cobleigh M, Tripathy D, et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first?line treatment of HER?2 overexpressing metastatic breast cancer[J]. J Clin Oncol, 2002, 20(3): 719?726.
[6] Slamon DJ, Leyland?Jones B, Shak S, et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2[J]. N Engl J Med, 2001, 344(11): 783?792.
[7] Baselga J. Clinical trials of Herceptin?(trastuzumab)[J]. Eur J Cancer, 2001, 37 (suppl 1): S18?S24.
[8] Sparano JA. Cardiac toxicity of trastuzumab (Herceptin): implications for the design of adjuvant trials[J]. Semin Oncol, 2001, 28(1 suppl 3): 20?27.
[9] Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T, et al. Duplexes of 21?nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J]. Nature, 2001, 411(6836): 494?498.
[10]Wilda M, Fuchs U, Wossmann W, et al. Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion gene by RNA interference[J]. Oncogene, 2002, 21(37): 5716?5724.
[11]Shlomai A, Shaul Y. Inhibition of hepatitis B virus expression replication by RNA interference[J]. Hepatology, 2003, 37(4): 764?770.
[12]Kapadia SB, Brideau?Andersen A, Chisari FV. Interference of hepatitis C virus RNA replication by short interfering RNAs[J]. PNAS, 2003, 100(4): 2014?2018.
[13] Jacque JM, Triques K, Stevenson M. Modulation of HIV?1 replication by RNA interference[J]. Nature, 2002, 418(6896): 435?438.
