姜黄素诱导人结肠癌细胞株SW480凋亡及其bcl?2表达相关性研究
【摘要】 探讨姜黄素对人结肠癌细胞株SW480诱导凋亡的影响及其作用机制。方法 5～50μＭ姜黄素分别处理SW480细胞6～48h后，MTT法检测细胞的生长活性，流式细胞仪检测细胞周期，TUNEL法检测细胞凋亡，免疫组化法检测细胞内bcl?2蛋白表达水平。结果 MTT显示姜黄素对SW480细胞具有细胞毒作用，呈时间?浓度依赖性。FCM结果显示细胞周期中G0/G1期细胞比例增加，S期、G2/M期比例下降。TUNEL法显示凋亡细胞数增加，免疫组化结果显示bcl?2基因表达明显减弱。结论 姜黄素能抑制结肠癌SW480细胞的增殖并诱导细胞凋亡。其机制可能与干扰细胞周期及下调bcl?2基因表达有关。
【关键词】 姜黄素 结肠肿瘤 细胞周期 bcl?2基因
0 引言
姜黄素 (curcumin)是从姜黄中提取的酚性色素，属于天然酚类抗氧化剂，其主要药理作用有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗脂质过氧化、抗病毒、抗肿瘤等作用。研究表明，姜黄素能选择性地抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡[1，2]，但其中所涉及的机制仍然不十分明确。本研究探讨了姜黄素诱导结肠癌细胞株 SW480凋亡效应及其对bcl?2基因表达的影响，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 药物及细胞株 姜黄素为英国DAH公司产品。SW480人结肠癌细胞株由武汉大学典藏中心提供。
1.1.2 主要试剂 MTT(噻唑蓝)为美国Sigma公司产品。小牛血清、RPMI1640为美国GIBCO公司产品。细胞凋亡原位检测试剂盒为德国BoehringerMannheim公司产品。bcl?2免疫组化试剂盒为武汉博士德公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 SW480细胞在含10%小牛血清的RPMI1640培养基，37℃、5%CO2培养箱中常规传代培养。设对照组和实验组,并根据实验要求加入不同浓度的试剂。
1.2.2 噻唑蓝还原法(MTT法)检测细胞生长抑制率 取对数生长期细胞5×104个/ml，每孔0.2ml，接种于96孔组织培养板中，设PBS对照组和不同浓度(5～50μmol/L)的实验组，各设3个复孔。置37℃、5%CO2培养箱中培养， 分别作用6h、12h、24h、48h，实验终止前4h每孔加MTT(5mg/ml)工作液20μl，上机前除去培养液，每孔加200μl二甲基亚砜，在酶标仪(570nm波长)上测量各孔吸光度值(OD值)，按下列公式细胞生长抑制率。
抑制率(%)=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%
1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期 消化收集各实验组及对照组分别培养24h的细胞，调整细胞悬液浓度为1×106/ml，上流式细胞仪分析。用multicycle DNA分析软件进行细胞周期的测定。
1.2.4 TUNEL法检测细胞凋亡 操作步骤按试剂盒说明进行。结果判定：细胞核染为棕黄色的细胞被判定为凋亡细胞。随机选取5个高倍视野（400倍），分别计数凋亡细胞数和细胞总数，计算凋亡指数(apoptosis index，AI)。
AI=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%
1.2.5 免疫组化法检测bcl?2的表达 按照SABC试剂盒使用说明书操作。显色后用图像分析仪进行图像分析。随机测定100个细胞，测出阳性反应细胞的总面积(Area)和积分光密度(IOD)，然后求出平均光密度(Dλ)值。
1.2.6 统计学分析 实验数据以±s表示，进行方差分析。
2 结果
2.1 姜黄素对SW480细胞的生长抑制 对照组SW480细胞体外生长活跃，经5、10、20、50μmol/L姜黄素处理6～48h后，SW480细胞生长均不同程度地受到抑制，呈时间?浓度依赖性，见表1。
表1 姜黄素对SW480细胞的生长抑制作用（略）
2.2 姜黄素对SW480细胞周期的影响 正常状态下，癌细胞大多处于G1期，S期次之，G2/M期最少。对照组DNA组方图为典型肿瘤细胞的G0/G1、S、G2/M峰型。从表2可以看出，细胞周期发生明显变化。G0/G1期比例降低，S期、G2/M期比例均增高，呈剂量依赖关系。提示姜黄素可阻断癌细胞从G0/G1期到S期的。
2.3 TUNEL法检测细胞凋亡 结果显示，光镜下阳性细胞及凋亡细胞核染成棕黄色，细胞由梭形变成圆形，细胞皱缩，细胞核固缩，核碎裂等。由表3可以看出，姜黄素可诱导癌细胞凋亡，且呈剂量依赖关系，且各浓度组间差异具有显著性(P<0.05)，见图1。
表2 姜黄素对SW480细胞周期的影响（略）
表3 不同浓度姜黄素处理后细胞凋亡的检测结果（略）
a：P<0.05，b：P<0.01 vs control
2.4 bcl?2表达的免疫组化检测结果 bcl?2主要分布在细胞质中,其阳性表现为细胞质呈棕褐色。结果显示经姜黄素处理后bcl?2表达明显减弱，统计学分析有显著差异（P<0.05）。随着姜黄素浓度的增加，bcl?2表达阳性的细胞百分率逐渐降低，具有显著性差异（P<0.05），见表4，图2。
表4 SW480细胞bcl?2表达平均光密度的检查结果（略）
a：P<0.05，b：P<0.01 vs control
3 讨论
实验研究发现姜黄素可抑制胃癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌的发生[2?4]。本实验通过MTT法发现姜黄素对SW480细胞生长有明显的浓度依赖性抑制作用。流式细胞仪检测发现经姜黄素处理后SW480细胞G0/G1期细胞比例明显增多，S期和G2/M期细胞比例明显减少，说明细胞生长被阻滞于S期和 G2/M期，并且此作用同样具有浓度依赖性。Ｍehta等[5]报道，以姜黄素处理的数株人乳腺癌细胞均可发生G2/M期停滞，但未观察到细胞周期蛋白(cyclin)Ｂ的明显变化。经姜黄素处理的人结肠癌细胞HT29和HCT15也同样发生G2/M期停滞[6]。而许建华等[7]的研究表明姜黄素处理的人肝癌细胞BEL7402则发生S期停滞。这些结果表明，对于不同组织类型的癌细胞来说，姜黄素对细胞周期的调控可能存在不同的机制。本实验结果表明，姜黄素具有直接杀伤肿瘤细胞的作用，其干扰细胞周期使阻断于S期和 G2/M期可能是姜黄素抗癌作用的重要机制。
肿瘤的发生与细胞凋亡的异常有密切关系，肿瘤细胞凋亡是一个多基因参与调控的复杂过程，凋亡可使肿瘤细胞主动性自杀性死亡。其中bcl?2家族是其中最重要的基因之一，其编码的蛋白能抑制细胞凋亡。bcl?2通过许多刺激因素如神经营养和增长因子的缺乏、Ca++渗透、热休克、辐射和某些病毒等而阻止细胞死亡，可导致DNA受损的细胞持续生存、突变产物聚集，从而促进肿瘤的发生。它调节细胞凋亡的作用点可能是影响线粒体释放细胞色素C[8]。姜黄素能显著诱导H?ras转化的人乳腺上皮细胞MCF10A细胞凋亡，并在mRNA和蛋白水平下调bcl?2基因的表达[9]。Miyashita发现bcl?2蛋白能抑制抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡[10]。实验结果表明，姜黄素能诱导SW480细胞凋亡并降低bcl?2蛋白表达，提示该基因的表达与姜黄素诱导SW480的细胞凋亡有着密切关系。姜黄素诱导SW480细胞凋亡，其机制可能是通过下调bcl?2基因的表达来实现的，但其确切机制尚待进一步研究。
（本文图见封3）（略）
【】
［1］ 陈宏，张振书，张亚历，等. 姜黄素对大肠癌细胞周期的影响[J]. 胃肠病学和肝病学杂志，2000，9（2）:107?109.
[2] 闵智慧，李文惠. 姜黄素抑制人胃腺癌细胞增殖及对细胞周期的影响的研究[J]. 肿瘤防治研究，2004，31（4）：211?213.
[3] Sindhwani P，Hampton JA，Baig MM，et al.Curcumin prevents intravesical tumor implantation of the MBT?2 tumor cell line in C3H mice[J].J Urol，2001，166(4): 1498?1501.
[4] Holy JM. Curcumin disrupts mitotic spindle structure and induces micronucleation in MCF?7 breast cancer cells[J]. Mutat Res，2002，518(1): 71?84.
[5]Mehta K，Pantazis P，McQueen T，et al. Antiproliferative effect of curcumin (diferul? oylmethane) against human breast tumor cell lines[J].Anticancer Drugs，1997，8(5): 470?481.
[6] Chen H, Zhang ZS, Zhang YL, et al. Curcumin inhibits cell proliferation by interfering with the cell cycle and inducing apoptosis in colon carcinoma cells[J].Anticancer Res，1999，19（5A）：3675?3680.
[7] 许建华，赵蓉，柯丹如，等. 姜黄素对人肝癌BEL7402细胞杀伤动力学及周期时相的影响[J]. 福建医科大学学报，1998，32(3):236?239.
[8] Yang J，Liu X，Bhalla K，et al. Prevetion of apoptosis by bcl?2: release of cytochro? me C from mitochondria blocked[J]. Science，1997，275(5303): 1129?1132.
[9] Kim MS，Kang HJ，MOON A. Inhibition of invasion and induction of apoptosis by curcumin in H?ras?transformed MCF10A human breast epithelial cells[J]. Arch Pharm Res 2001，24(4): 349?354.
[10]Myashita T，Reed JC. bcl?2 oncoprotein blocks chemotherapy induced apoptosis in a human leukemia cell line[J].Blood，1993，81(1):151?157.
