凝血酶促进肿瘤血管生成机制研究进展
【关键词】 凝血酶 肿瘤 血管生成
0 引言
自从 1878 年 Billroth 在实验观察的基础上提出在肿瘤转移和凝血机制之间存在某种联系的假说以来，人们对凝血系统和肿瘤的关系进行了广泛而深入的研究。临床、实验室、组织病研究均证实，多数肿瘤患者均伴有不同程度的血凝激活现象而表现为所谓的“高凝状态”或“低级别的DIC”。 例如，血液肿瘤患者循环体系中高水平的纤维蛋白肽，它能导致血管外快速的凝血和纤维化，另外，许多类型的肿瘤细胞表达穿膜蛋白组织因子，当这些因子暴露于血液中的Ⅶ因子时，能激活Ⅹ因子导致凝血酶的产生和纤维素形成，肿瘤细胞还通过与血小板、白细胞、内皮细胞的相互作用, 直接或间接诱导促凝血活动。近来， zacharsky 等人也发现凝血酶存在于许多类型的肿瘤细胞，这些发现解释了肿瘤患者的高凝现象，但并不能回答凝血酶与肿瘤发生、 是否存在直接的关系。
流行病学调查发现发生血管栓塞的病人, 其后 6 个月肿瘤发生率增加了 3～6倍, 一年后肿瘤发生率则增加了6～7倍，动物实验也证明凝血酶诱导的小鼠 Be16 黑色素肿瘤细胞肺转移的潜能明显增加。有证据表明［1］，凝血酶促进肿瘤生长转移主要是因为凝血酶有促进肿瘤血管生长的作用，这种促血管生成的作用在鸡胚尿囊膜实验和体内的 matrigel 系统中均得到了证实，并发现此效应是通过特殊凝血酶受体PAR?1介导完成的, 与纤维素的形成无关。
凝血酶［2］及受体［3］在肿瘤的血管形成中发挥了重要的作用, 而血管新生是肿瘤生长转移的必要条件。凝血酶可促进肿瘤细胞和内皮细胞的生长、增强肿瘤细胞的致瘤性，增加体外肿瘤细胞与肿瘤微环境中各种成分的黏附，加快细胞在体内的转移过程，诱导血管生长因子的合成和分泌，是一种潜在的促血管生长因子, 与肿瘤的发生、发展有密切的关系。现就凝血酶及受体促肿瘤血管生成作用及其相关机制作一综述。
1 凝血酶诱导血管生成的分子机制
绝大部分凝血酶效应是通过激活的凝血酶受体PAR?1介导的。PAR?1是凝血酶的主要受体，不同于其他细胞膜受体, 它不是以简单的受体－配体复合物的形式激活, 而是受体作为配体溶解消化的产物。凝血酶以蛋白裂解的方式特异性裂解细胞外PAR?1 N?末端的 Arg41 和Ser42之间的残基, 使之暴露一个新的“被限制的配体”, 后者与受体本身第 2 个袢的细胞外区结合而使其不可逆的激活, 继而转录其他细胞信号。
凝血酶受体PAR?1与肿瘤细胞的恶性表性密切相关，通过检测乳腺癌细胞系和组织标本，发现PAR?1过表达和肿瘤转移潜能有直接的关系，恶性程度高的肿瘤组织或细胞，PAR?1表达非常高的水平，而正常或癌旁乳腺组织标本并不能检测到PAR?1的表达。凝血酶受体结合的多种G?蛋白决定了凝血酶的分子特性，涉及的信号转导机制包括磷酸酶C、A2, 蛋白激酶C、促有丝分裂蛋白酶、酪氨酸激酶、腺苷酸脱氨酶，通过这些机制发挥分子效应［4］。
2 凝血酶与血管内皮生长因子
血管内皮生长因子（VEGF）和它的两个特异性受体（KDR, fit?1）在生理和病理状态下的血管生成过程中均具有十分重要的作用。VEGF和受体KDR、fit?1在几乎所有人体肿瘤组织和肿瘤细胞中均有过表达, 而在正常成熟的血管组织表达水平较低。VEGF与内皮细胞上的相应受体 KDR、fit?1结合引起内皮细胞的分裂和分化，并形成管腔样结构，促进内皮细胞产生并调节纤溶酶原激活物抑制因子，增加血管通透性, 在血管生成过程中发挥重要的作用。
研究发现凝血酶能促进脐静脉内皮细胞 （HUVEC） 对 VEGF有丝分裂作用的敏感性，对内皮增殖效应有协同作用［2］。这种协同作用是剂量依赖和受体介导的，并且具有特异性的，其作用能被凝血酶的特异性抑制剂水蛭素所抑制。同时，凝血酶能提高内皮细胞VEGF受体KDR、fit?1 mRNA的表达，凝血酶与内皮细胞共培养12h后，受体KDR的功能蛋白相对于对照组增加了200‰，这种上调作用是在转录水平完成的，这与凝血酶在（小于1.5IU ）浓度范围内促进内皮细胞增殖的观察结果相一致。结合凝血酶同时促使前列腺癌及神经胶质瘤细胞VEGF的分泌，提示凝血酶可能导致肿瘤细胞与内皮细胞的相互作用，进一步促进肿瘤细胞的生长和血管形成。
3 凝血酶与血管生成素
另一个在血管生成过程中发挥重要作用的蛋白家族是血管生成素。血管生成素是一种14.1kd 碱基多肽，有Ang?1和Ang?2两种，分别通过激活或阻碍内皮细胞特异性酪氨酸激酶受体Tie?2/Tek调节血管形成。Ang?1和受体Tie?2结合，促进内皮细胞与血管壁细胞相互作用，使原始血管塑形、成熟，并维持和稳定其成熟性。Ang?2的功能与Ang?1相拮抗，可阻止Ang?1和受体Tie?2结合，在VEGF缺乏时使血管失稳定，而当高水平VEGF存在时，这种去稳定作用则有利于血管新生，同时缺氧和 VEGF 能够上调Ang?2的表达。Ang?2在肿瘤发生的转移中的作用已被Yancopoulos和同事的研究工作所证明。
凝血酶上调脐静脉内皮细胞中Ang?2 mRNA的表达及Ang?2蛋白的合成和分泌［5］，脐静脉内皮细胞在凝血酶处理4h后， Ang?2 mRNA表达相对于对照组增加了 4 倍， 8 h后Ang?2蛋白的合成和分泌分别增加了2.5倍和3.5倍。凝血酶诱导脐静脉内皮细胞中Ang?2 mRNA表达上调是因为提高了Ang?2基因的转录水平，并没有改变Ang?2 mRNA的稳定性，这种作用也是受体依赖的。
凝血酶并不能改变成纤维细胞生长因子的分泌和表达，表明凝血酶在促进血管生成的分子机制中，主要是通过调节血管内皮生长因子和血管生成素来实现调控机制的。
4 凝血酶与整合素
整合素αυβ3在血管重构和新生的过程中表达于血管细胞，并影响肿瘤细胞的恶性表型，被认为是内皮细胞血管生成现象的标志物。整合素αυβ 3的抗体或拮抗剂在细胞黏附分子系统和兔角膜模型中能抑制成纤维生长因子诱导的血管生成作用，研究发现整合素αυβ 3 拮抗剂是通过诱导新生血管凋亡而非成熟血管来抑制肿瘤血管生成。
Tsopanoglou等［6］报道，凝血酶显著提高脐静脉内皮细胞整合素αυβ 3 mRNA 和蛋白的表达。凝血酶诱导脐静脉内皮细胞整合素αυβ 3 mRNA 和蛋白的表达，是否凝血酶诱导肿瘤血管生成的机制也涉及整合素介导的各种效应，如细胞粘附、迁移、 生存? 研究发现，整合素黏附于稳定的凝血酶，这个过程是剂量饱和浓度依赖性的，凝血酶的结合位点并不涉及此过程，另外，凝血酶可能充当了内皮细胞的趋化因子，稳定的凝血酶和DIP?凝血酶诱导内皮细胞的迁移，迁移作用能被αυβ 3抗体（ LM609 ）完全阻止。当培养液中缺乏血清时，内皮细胞发生凋亡，但经凝血酶包被的培养皿，内皮细胞生存期延长，凋亡率下降，加入抗αυβ 3 抗体后内皮细胞凋亡率又明显上升，表明凝血酶提高内皮细胞的生存能力依赖于整合素αυβ 3的作用，而这种生存能力是内皮细胞在血管生成过程中从基底膜向远处迁移所必需的。研究同时发现，当内皮细胞与凝血酶共培养8～12h后，整合素αυβ 3 mRNA 表达明显增加的同时，内皮细胞向明胶及血浆蛋白运动和结合的能力也随之明显提高，这种现象可以解释我们在临床中观察到的结果—血栓内部的血管新生和重构现象，凝血酶在血浆中很快失活，但在血栓中被保护，从而激活血管生成。
近来实验发现凝血酶的RGD序列在依赖整合素αυβ 3的血管生成过程中具有重要作用，合成的凝血酶TP508缺乏凝血酶的结合位点但包含了RGD序列，同样能诱导整合素αυβ 3的内皮细胞的迁移和黏附，而改良的TP508包含 RAD 序列，但缺乏RGD序列）活性显著降低［7］。
5 凝血酶与基底膜
肿瘤的血管生成还涉及血管外基质成分的改变、基底膜的降解、内皮细胞的增殖、迁移和芽生，大量的体外研究已证实凝血酶对这些过程起促进作用。PAR?1被发现不仅表达于恶性肿瘤细胞，而且包括组成肿瘤微环境的各种细胞类型，诸如内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、血管壁细胞、正常的纤维母细胞［8］, 也提示凝血酶可能通过降解和重构基底膜促进细胞的转移。凝血酶抑制内皮细胞与基底膜胶原蛋白Ⅳ或层粘连蛋白的黏附性，增加其运动能力，同时激活的凝血酶还有化学趋化的作用，可诱导内皮细胞向高浓度丝氨酸激酶的肿瘤微环境迁移，而内皮细胞再通过整合素αυβ 3介导与其他胞黏附，此外，凝血酶还能激活金属基质蛋白酶MMP?2， 基底膜胶原蛋白Ⅳ型胶原［9］，不仅有利于内皮细胞穿过基底膜向远处转移，同时可以使基底膜外的促血管因子与血管内成分相互作用。研究发现凝血酶对金属基质蛋白酶 MMP?2的激活作用依赖整合素αυβ 3的存在，αυβ 3和MMP?2共存在于微血管的表面，由此推断凝血酶激活αυβ3和MMP?2促血管生成的作用不是孤立的，而是相互联系的。
6 其他
凝血酶和受体激活能提升结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞的生长和转移能力［10］。凝血酶及受体通过动员各种黏附分子［11］，诸如α 2 b β 3， P选择素, CD40在细胞表面表达，提高ICAM mRNA的合成，或者并不改变其表达水平，而影响整合素αυβ 5在肿瘤细胞表面的分布［12］，增加肿瘤细胞之间，肿瘤细胞与内皮细胞, 血小板、细胞外基质的黏附能力，从而促进肿瘤的转移。凝血酶还能激发生长因子、化学激酶、细胞蛋白的释放，诱导肿瘤细胞的增殖和转移。这些效应也在一定程度上有利于肿瘤血管的生成。
此外［13］，凝血酶?受体PAR?1下调肿瘤转化因子(TGF?β)信号通路的重要介质Sinad2, 而TGF?β在血管生成的消退阶段具有重要的作用，这可能是凝血酶促肿瘤血管生成的又一机制。
7 应用
以凝血酶及受体为靶向的肿瘤抗凝旨在影响肿瘤的生长转移和促凝特性，肝素、阿司匹林、华法林等凝血酶抑制剂防治肿瘤的作用已在动物实验及临床应用中得到了证实。
Sylvester等研究证明，在黑色素细胞B16BL6致瘤的动物模型中，肝素和干扰素、肿瘤坏死因子联合使用，会增加后两者的抗肿瘤效应，降低实体瘤的体积和微血管密度，加快活性凝血因子的失活，以及肝素可以明显降低注射LS180瘤细胞后的小鼠实验肺转移，最近，动物实验证实［14］凝血酶的特异性抑制剂水蛭素可通过抑制内源性的凝血酶而抑制肿瘤的生长和降低肺转移。同时有数据显示，在肿瘤患者的抗凝治疗过程中，特别是肺癌患者，有系统的使用小剂量的华法林或小剂量肝素可以提高患者生存率。
综上所述，凝血酶及其受体在肿瘤的血管生成过程中发挥了重要的作用，凝血系统在肿瘤发生中所起的作用越来越受到人们的重视，如何通过抑制凝血酶及其受体途径达到治疗或协同其他治疗手段抑制肿瘤，研发新的抗肿瘤药物，有待进一步研究。
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